[发明专利]新城疫病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测新城疫病毒的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测新城疫病毒的方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种禽的急性、高度接触性传染病，对养禽业危害严重。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定通报传染病，我国亦将其定为一类动物传染病。

随着高度集约化养禽业的发展，ND的防治备受关注。ND的现场诊断主要依靠发病史、临床症状、病理变化和流行病学调查综合判定，这给广大兽医工作人员带来了超负荷的工作，耗时费力费钱。现场诊断工作中急需快速准确的筛检诊断方法，以利于现场疫情的确认。因此，ND疫情现场快速确认，对于采取果断有效的扑灭和防控措施十分关键。

在本发明之前，OIE规定区分NDV毒力的经典方法主要有鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)、静脉致病指数(IVPI)测定等方法。这些方法报告结果时间长，工作量大。而目前普遍采用的聚合酶链反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程繁琐的缺点。荧光实时定量聚合酶链反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但需要更复杂的定量测定仪器，因此不适于现场快速检测，同时由于检测成本较高，也加大了推广应用的难度。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种新城疫病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法。

本发明的技术方案是：

一种新城疫病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

(1)反应液A：

含有10×等温反应缓冲液、AMV 8U/μl、Rnas in 40U/μl、Bs t DNA聚合酶8U/μl、10mM dNTP、100mM硫酸镁、20μM内引物1、20μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和5M甜菜碱，其中：

10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/pH8.8、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

内引物1为：TCCTTAAGCCGGAGGATGTTGGTTTTGCAACAGCTGCACAGATAAC

内引物2为：ACTGACGGATTATCACAACTAGCTTTTGGTCATTAACAAACTGCTGCA

外引物1为：TTATYGGYRGTGTRGCTCT

外引物2为：TCRGTTAGGTAYARGTTGAG

(2)反应液B：1000×的荧光染料SYBR Green I。

本发明的另一技术方案是：

一种新城疫病毒LAMP检测试剂盒检测新城疫病毒的方法，其主要技术步骤包括：

(1)组织样品中RNA的提取

A.取脑、肝等组织0.5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，将粉末置于1.5ml离心管中，加入1ml Trizol液后，剧烈摇匀，室温放置5-10min；

B.加入200μl氯仿，剧烈摇匀，室温放置3-5min；

C.12,000×g离心15min；

D.吸取上清，加入糖元8-10μg混匀2min后加入异丙醇500μl，混匀，室温放置10min；

E.12,000×g离心10min，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2min；

F.7,500×g离心5min，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5min后加入8μl ddH₂O溶解，即为待检RNA，-20℃冰箱中保存备用；

(2)家禽咽喉、泄殖腔棉拭子样品中RNA的提取

取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300μl生理盐水中10min，12,000×g离心15min，取上清200μl，采用(1)中从组织样品中提取RNA的方法提取RNA；

(3)新城疫病毒的环介导等温扩增

在装有23μl反应液A的反应管中加入2μl待检RNA，于60-65℃恒温水浴箱中放置90min；

(4)扩增产物的显色检测

在上述反应管中加入1μl反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有新城疫病毒；如果颜色为黄色，说明待检样品不合有新城疫病毒。