[发明专利]新城疫病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种新城疫病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

(1)反应液A：

含有10×等温反应缓冲液、AMV 8U/μl、Rnas in 40U/μl、Bs t DNA聚合酶8U/μl、10mM dNTP、100mM硫酸镁、20μM内引物1、20μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和5M甜菜碱，其中：

10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/pH8.8、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

内引物1为：TCCTTAAGCCGGAGGATGTTGGTTTTGCAACAGCTGCACAGATAAC

内引物2为：ACTGACGGATTATCACAACTAGCTTTTGGTCATTAACAAACTGCTGCA

外引物1为：TTATYGGYRGTGTRGCTCT

外引物2为：TCRGTTAGGTAYARGTTGAG

(2)反应液B：1000×的荧光染料SYBR Green I。

2.根据权利要求1中所述的一种新城疫病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于反应液A每管23μl的组成为：2.5μl 10×等温反应缓冲液、1.0μl AMV(8U/μl)、0.25μl Rnasin(40U/μl)、1.0μl Bst DNA聚合酶(8U/μl)、1.5μl 10mM dNTP、1.5μl 100mM硫酸镁、2.0μl 20μM内引物1、2.0μl 20μM内引物2、0.5μl 10μM外引物1、0.5μl 10μM外引物2、5.0μl 5M甜菜碱和5.25μl DEPC处理水。

3.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒LAMP检测试剂盒检测新城疫病毒的方法，其步骤包括：

(1)组织样品中RNA的提取

A.取脑、肝等组织0.5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，将粉末置于1.5ml离心管中，加入1ml Trizol液后，剧烈摇匀，室温放置5-10min；

B.加入200μl氯仿，剧烈摇匀，室温放置3-5min；

C.12,000×g离心15min；

D.吸取上清，加入糖元8-10μg混匀2min后加入异丙醇500μl，混匀，室温放置10min；

E.12,000×g离心10min，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2min；

F.7,500×g离心5min，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5min后加入8μl ddH₂O溶解，即为待检RNA，-20℃冰箱中保存备用；

(2)家禽咽喉、泄殖腔棉拭子样品中RNA的提取

取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300μl生理盐水中10min，12,000×g离心15min，取上清200μl，采用(1)中从组织样品中提取RNA的方法提取RNA；

(3)新城疫病毒的环介导等温扩增

在装有23μl反应液A的反应管中加入2μl待检RNA，于60-65℃恒温水浴箱中放置90min；

(4)扩增产物的显色检测

在上述反应管中加入1μl反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有新城疫病毒；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有新城疫病毒。