[发明专利]黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以黄瓜Flamingo-bill外植体为受体的转基因方法，所属领域为植物基因工程领域。

背景技术

黄瓜是世界上十种最主要的蔬菜作物之一，也是我国保护地生产的第一大蔬菜作物(FAO，http://faostat.fao.org/faostat，2005)，在蔬菜生产和供应上有着举足轻重的作用。但黄瓜遗传背景狭窄，通过有性杂交育种难以实现有用新品种的突破(Dijkuizen A，Kennnard WC，Havey MJ，et al.RFLP variability andgenetic relationships in cultivated cucumber[J].Euphytica，1996，90：79-87)。通过基因转移技术，不仅可实现不同物种之间基因的转移，还可以对个别性状进行定向改良，是目前遗传背景狭窄的作物获得突破性品种的重要技术保障。

当前的植物转基因技术主要有：基因枪转化技术、农杆菌介导的转化技术、病毒介导的转化技术、花粉管通道技术、聚乙二醇融合技术等，其中以农杆菌为介导的遗传转化因技术成本低、操作简便，是目前应用最为广泛的遗传转化体系，是当前包括黄瓜在内的许多植物的基因工程育种的重要手段。但由于物种之间、甚至同一物种不同基因型之间的差异以及影响转化效率的技术参数众多，目前尚无固定的遗传转化技术体系(Cheng M，Brenda AL，Michael S，et al.A invited review：factors influencing Agrobacterium mediated transformation ofmonocotyledonous species[J].In Vitro Cell Dev Biol-Plant，2004，40：31-45)。

目前，对黄瓜进行遗传转化的报道较多，所采用的技术有基因枪转化法(Kuroda H，Masuda T，Fusada N，et al.Cytokinin-induced transcriptionalactivation of NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase gene in cucumber.JPlant Res，2001，114：1-7)、聚乙二醇诱导融合法(徐华强，汤辉仙.大白3菜和黄瓜原生质体电击基因转移的研究[J].植物学报，1991，33：7-13)和花粉管通道法(董伟，陈玲，吴勇.黄瓜自花授粉后外源DNA导入技术研究[J].园艺学报，1993，20：155-160；郭亚华，邓立平，杨晓辉.采用花粉管通道技术将外源DNA导入黄瓜青椒研究初报[J].哈尔滨师范大学，1995，11：82-85)，但这些方法普遍存在着明显的不足，诸如植株再生时间长、转化效率低、受环境影响大、技术规范性差等，因而在实际应用中不能普及。以农杆菌介导的遗传转化是目前黄瓜转基因的一种常用方法。据报道，采用子叶(Chee PP.Transformation of Cucumis sativus tissue by Agrobacterium tumefaciens and theregeneration of transformed plants[J].Plant Cell Rep，1990，9：245-248；王惠中，赵培杰，周晓云.转WMV-2cp基因黄瓜植株的再生[J].植物生理学报，2002，26：267-272；纪巍，李杰，朱延明，等.不同启动子调控的DREB1A基因对黄瓜的遗传转化[J].东北农业大学学报，2005，36：442-47)、真叶(Sarmento GS，Alpert K，Tang FA，et al.Factors influencing Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation and expression of kanamycin resistance in pickling cucumber[J].Plant Cell Org Cult，1992，31：185-193)、下胚轴(Nishibayashi S，Kaneko H，Hayakawa T.Transformation of cucumber plants using Agrobacterium tumefaciensand regeneration from hypocotyl explants[J].Plant Cell Rep，1996，15：809-814)和胚性悬浮系(Raharjo SHT，Hernandez MO，Zhang YY，et al.Transformation ofpickling cucumber with chitinase-encoding genes using Agrobacteriumtumefaciens[J].Plant Cell Rep，1996，15：591-596)为转化受体均获得了转基因植物。与前述相似，这些研究方法也存在转化效率低(1～3％)、植株再生时间长(45～60d)等问题。