[发明专利]黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法

权利要求书

1、一种黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是采用黄瓜Flamingo-bill外植体为基因转化的受体，通过农杆菌介导将报告基因GUS基因导入受体，利用卡那霉素对转化后的植株进行初步筛选得到抗性植株，然后对抗性植株进行PCR分子鉴定和GUS染色获得转基因植株。

2、如权利要求1所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是包括下列步骤：

a、将黄瓜种子表面消毒，接种到MS培养基，使之成苗；取适宜苗龄幼苗切除其一片子叶及生长点，制备Flamingo-bill外植体；并将Flamingo-bill外植体置于含有6-苄基腺嘌呤的MS培养基预培养；

b、挑取含有目的基因的农杆菌LBA4404菌落，加入到YEB液体培养基中震荡培养，二次活化后离心收集菌体，并用1/2MS液体培养基悬浮，并稀释至终浓度，其OD₆₀₀值在0.48～0.50之间，以此作为工程菌液；

c、将经过预培养的Flamingo-bill外植体浸入工程菌液，然后将侵染过的外植体取出放在灭菌滤纸吸干菌液，接种于附加6-苄基腺嘌呤MS培养基共培养，直到外植体周围有菌液溢出；

d、用无菌水冲洗经过共培养的Flamingo-bill外植体2～3次，再用300～400mg/L头孢霉素浸洗20～30s后，接种于附加6-苄基腺嘌呤、AgNO₃、蔗糖、头孢霉素和卡那霉素的MS培养基选择培养；

e、待芽长到1～2cm，从基部将其切离外植体，接种于为附加蔗糖、头孢霉素和卡那霉素的MS固体培养基生根培养，直到长成完整植株；

f、对转基因植株进行分子鉴定。

3、根据权利要求2所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：步骤a中用于黄瓜Flamingo-bill外植体制备的幼苗为无菌幼苗，苗龄为2～3d，切口深度为下胚轴直径的1/2，切口斜面长度为0.4～0.5cm。

4、根据权利要求2所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：步骤a中预培养的培养基为附加0.1～0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、30～35g/L蔗糖的MS液体培养基，预培养时间为2～3d。

5、根据权利要求2所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：步骤c中农杆菌菌液侵染Flamingo-bill外植体的时间为18～20min。

6、根据权利要求2所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：步骤c中共培养所用培养基含有0.1～0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤和30～35g/L蔗糖的MS培养基，共培养的接种方式为外植体切口斜面接触培养基。

7、根据权利要求2所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：步骤d中初始选择培养基为附加0.5～1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.5～1.0mg/LAgNO₃、30～35g/L蔗糖、300～400mg/L头孢霉素和100～150mg/L卡那霉素的MS固体培养基，继代选择培养基为附加0.1～0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、30～35g/L蔗糖、100～200mg/L头孢霉素和50～100mg/L卡那霉素的MS固体培养基。

8、根据权利要求7所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：经共培养后的Flamingo-bill外植体的接种方式是将根部斜插入选择培养基，初始选择培养基上培养2次，7～10d一次，继代培养基上培养1～2次，10～12d一次。

9、根据权利要求2所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：步骤e中生根培养基中含有20～25g/L蔗糖、100～200mg/L头孢霉素和20～60mg/L卡那霉素。

10、根据权利要求2至9任一所述的黄瓜Flamingo-bill外植体转基因方法，其特征是：所述植物组织培养各个阶段，培养温度为25～28℃，除了步骤a预培养和步骤c共培养两个培养阶段不需要光照外，培养条件为光强54～56μmol·m^-2·s^-1，光周期14～16h/d。