[发明专利]OPG-HSP70融合蛋白的制备方法及用途

说明书

                             技术领域 

本发明涉及使用大肠杆菌表达制备重组骨保护素-热休克蛋白70(OPG-HSP70)融合蛋白的方法，含有由该方法制备的重组骨保护素-热休克蛋白70(OPG-HSP70)的药物制剂以及该药物制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎中的药物中的用途。 

                             技术背景 

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种T细胞介导的，以滑膜炎症为主要特征，同时伴有关节软骨及骨损伤的自身免疫性疾病。RA在中国的患病率为0.32％～0.38％，且致残率高，RA给劳动力、社会经济造成的损失是巨大的。而RA又是一种难治性疾病，虽然现有治疗手段多种多样，但都不甚理想。本发明针对RA发病中骨损伤及慢性炎症反应这两个相关联的RA的关键性病理学问题，研制OPG-HSP70融合蛋白，为RA的治疗开辟了一种新的思路。 

近几年，对于破骨细胞(osteoclast，OC)的研究不仅引发了免疫调节、骨代谢疾病中的理论研究，也为临床诊断和治疗骨代谢性疾病提供了新的依据。对OC从细胞生物学和分子生物学方面等进行的研究，开辟了各种骨相关疾病的药物研发的新领域(N Engl J Med.2005，353(9)：872-75)。由于OC是形成侵蚀性关节炎的必要成分，因此其可以作为RA治疗的一个靶点。 

OC的分化和/或功能变化所导致的骨再建失衡是多种代谢性骨病，如骨质疏松症、骨质硬化症和畸形性骨炎(Paget骨病)等形成的病理基础。目前已经证明多种激素和局部细胞因子如活性维生素D3、糖皮质激素、甲状旁腺素(PTH)、前列腺素(PGE2)、IL-6、IL-11、IL-12等不仅能调节OC生成，还能调节OC的功能。这些因子主要作用于成骨/基质细胞，通过调节骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和NF-κB受体活化因子配体(receptor activatorofNF-κB ligand，RANKL)的表达，调控OPG、RANKL和NF-κB受体活化因子(receptoractivator ofNF-κB，RANK)之间的比例，介导OC生成并维持其功能。因此OPG、RANKL及RANK是OC的最终调节因子。3种分子在OC分化成熟过程中的相互关系及作用机理的阐明，为多种代谢性骨病的防治提供了理论依据(Curr Opin Rheumatol.2003，15(3)：280-7)。 

1997年OPG被发现，它属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，有单体和由二硫键连接的同源二聚体两种形式，分子量分别为60 kD和120 kD。单体存在于成骨细胞内，而二聚体可分泌入基质中，是一种分泌型糖蛋白。OPG在进化中高度保守，大鼠和小鼠OPG 的同源性为94％，小鼠和人OPG的同源性为89％。OPG最初含401个氨基酸残基，在合成过程中因去除21个氨基酸残基组成的信号肽，最终成为含380个氨基酸的成熟蛋白质。其N端有4个富含半胱氨酸的功能域(D1～D4)与其配体结合，C端与已知的蛋白没有同源性。许多组织器官可以表达OPG mRNA，如肺、心脏、肾脏、肝、胃肠、脑、脊柱、甲状腺等，其主要作用是抑制骨吸收(Cell.1997，89(2)：309-19)。实验表明，去除OPG的C端部分(至194aa)并不影响OPG活性，因此包括TNFR样功能区的OPGN端序列对于抑制OC分化成熟是必需的也是足够的。