[发明专利]无动物细胞培养方法

说明书

本申请是申请日为2004年3月1日的发明创造名称为“无动物细胞培养方法”的中国专利申请(国家申请号为No.200480005848.8，国际申请号为PCT/EP2004/002067)的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于在没有一级动物来源的外源成分的条件下培养动物，如哺乳动物的细胞的方法，具体地讲，用于培养动物，如哺乳动物或优选人，二倍体贴壁依赖性细胞，并且涉及基本上不含一级动物来源的外源成分的、适合执行所述方法的细胞培养基。具体地讲，本发明涉及包括至少一种，更优选若干种，无外源动物的生长因子的细胞培养基。所述培养基特别适合培养动物，如哺乳动物，或优选人类二倍体贴壁依赖性细胞，例如，与用于所述细胞类型的补充了合适血清的基础培养基具有等同的性能。本发明还涉及在本发明的培养基中培养动物，如哺乳动物，优选人二倍体贴壁依赖性细胞的方法，包括将非动物来源的胰蛋白酶代用品用于使细胞传代。本发明还涉及生产病毒，和人病毒疫苗等的方法。

背景技术

贴壁依赖性细胞，特别是二倍体贴壁依赖性细胞被用于多种方法中：用于大规模生物方法中生产保健品，如疫苗和重组蛋白，用于制备用来治疗人体损伤的人工组织，用于实验研究，用于体外毒理学研究，用于筛选和测试新的药物等。

通常，贴壁依赖性细胞是在含有血清或作为血清代用品的动物来源的成分，如牛血清白蛋白(BSA)或蛋白质水解产物的培养基中培养的。血清或动物来源的成分还用在细胞转种和细胞低温贮藏期间。血清是代谢物，激素，维生素，铁(转铁蛋白)，转运蛋白，附着因子(例如，粘连蛋白)，扩散和生长因子的主要来源。它是很多动物细胞培养物在体外生长所需要的。另外，血清起着抗多种干扰和毒性作用，如pH改变，重金属离子的存在，蛋白质水解活性，或内毒素的缓冲剂的作用。白蛋白是血清的主蛋白成分，并且能产生若干种作用，这些作用导致了细胞在培养物中的生长和维持：它起着多种小分子的载体蛋白的作用，并且起着脂肪酸的转运蛋白的作用，这些脂肪酸是细胞所必需的，但是在非结合形式下是有毒的。

二倍体贴壁依赖性细胞通常在塑料表面，玻璃表面或微载体上生长。所述细胞通过诸如粘连蛋白的附着因子附着和扩散(F.Grinnel&M.K.Feld Cell，1979，17，117-129)。胰蛋白酶是在细胞传代期间用于细胞脱离的最常见的动物来源的成分之一(M.Schrder&P.Friedl，Methods in Cell Science，1997，19，137-147；O.W.Mertens，Dev Biol Stand.，1999，Vol 99，PP 167-180)。在细胞脱离之后，必须通过血清或大豆胰蛋白酶抑制剂对它进行抑制，以便避免细胞损伤。在脱离之后，细胞以低密度接种在新的表面上，在这里，它们能够增殖，并且形成汇合的细胞层，然后进行下一次转种。对粘附细胞进行传代的目的是增殖，并且获得足够数量的细胞，以便实施上述方法。

有多种与将血清和动物来源的成分用于上述方法中相关的缺陷，主要是它们的成本，它们的组成在不同批次之间的波动性，它们与被外来制剂污染的较高风险相关性，以及随后在后续处理中遇到的难题(例如，纯化，以便消除血清-蛋白或所述导入的动物来源的蛋白)。另外，据报导无血清培养基不适合贴壁依赖性二倍体细胞(O.W.Mertens，Dev Biol Stand.，1999，Vol 99，pp 167-180；O.W.Merten，Dev.Biol.2002，101，233-257)。