[发明专利]一种改进的农杆菌介导浸花法转化禾本科作物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改进的由农杆菌介导的浸花法转化禾本科作物的方法与应用，特别是涉及转化甜高粱、谷子和玉米的方法与应用。

背景技术

粮食生产主要可分为两种，一种是提供食用的粮食，一种是为生物能源提供原料的粮食。甜高粱是一种重要的能源植物。上世纪70年代的石油危机引发了人类对生物燃料代替石油的研究，美国和巴西用玉米和甘蔗生产燃料乙醇获得成功。现在，由于化石能源的渐趋枯竭和环保的需要，发展生物质产业成为许多国家的重要发展战略。我国的粮食还不那么富裕。生产液体生物燃料还得找其他途径。甜高粱有很高的光合效率，有“高能作物”之称，是目前世界上生物学产量最高的作物。甜高粱茎秆中含糖丰富，是粮食生产酒精最好的替代物。每亩甜高粱的酒精产量约为玉米、甜菜和小麦的2倍；比甘蔗还高1/4；籽粒既可食用，又可作饲料和工业原料。我国有1亿多公顷贫瘠的边际性土地，如果种上能源植物，产出的燃油会相当可观。我国的汽车保有量2020年将达到2.2亿辆，每年汽车就将消耗汽油2.2亿吨，国内目前的石油产量远远不够用。种植利用甜高粱可以极大地缓解我国能源危机。

谷子起源于我国，我国的种植面积占世界的80％。谷子是粮草兼用型作物，它具有耐旱、耐瘠薄、抗逆性强、产量平稳、营养价值高等特征。

玉米原产于南美洲，适合旱地种植。玉米是三大粮食品种之一，为解决人类的温饱问题起到很大作用。此外饲料消费也是玉米最重要的消费渠道，约占消费总量的70％左右。作为工业原料使用也是玉米消费的主要渠道。玉米可开发产品众多，是粮食作物中用量最大的工业原料。玉米广泛用于生产淀粉、造纸、食品、纺织、医药等行业。以玉米淀粉为原料生产的酒精是一种清洁的“绿色”燃料，有可能在21世纪取代传统燃料而被广泛使用。

以上三种作物在我国的粮食生产中占重要地位，但目前对其研究还停留在常规育种上。因其难于进行组织培养及转化再生能力差等问题，要应用基因技术改良性状，还比较困难。

目前的转基因技术可分为物理法、化学法及生物学法。无论那一种方法，都要依靠转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养植株再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。但是该途径有其局限性，如组织培养及转化再生能力的基因型依赖性比较强，而且有些物种难于进行组织培养，以及逃逸体、嵌合体、转化率低下、过敏反应导致感染部位的褐化坏死、细胞脱分化和再分化中产生的体细胞变异以及转基因株的育性降低或丧失都有可能干扰转基因植株的分析及应用。植物原位转基因方法是一种不需要组织或细胞培养手段而达到植物在活体而非离体手段状态下的转化。浸花法转化是植物原位转基因方法中的一种，是利用材料花序与农杆菌接触，在活体条件下，完成可遗传细胞的转化，并通过对后代的筛选，获得转化株。目前浸花法转化已应用于双子叶植物十字花科的芸薹属作物中并获得成功，利用浸化花法转化禾本科作物未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种改进的浸花法转化禾本科作物的方法。

本发明所提供的浸花法转化禾本科作物的方法包括以下步骤：

1)将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有Silwet L-77、曲拉通X-100(Triton X-100)和赤霉素(GA)；

2)在活体条件下进行浸花法转化：将待转化的目的植株的全部花序或雌蕊部分浸泡于上述渗透培养基中，或者将上述渗透培养基喷洒于花序或雌蕊上，利用农杆菌将目的基因整合到目的植株基因组中。

浸花法转化可在外界的强压下进行，也可在常温常压下进行。目前应用较多的浸花法转化要进行抽真空处理，但是对于株型较大的植物品种进行抽真空处理则不太可行。在常温常压下进行转化时，渗透培养基中需要添加能够帮助提高渗透能力的表面活性剂，通常添加的是有机硅表面活性剂Silwet L-77。在本发明的研究中，除了Silwet L-77外，还首次添加了另外两种成分：Triton X-100(曲拉通X-100)和GA。Triton X-100是一种非离子表面活性剂，可作为润湿剂、乳化剂、清洁剂使用，它能够溶解脂质，增强细胞膜的通透性，使农杆菌更容易进入植物体内。GA即赤霉素，能促进细胞的伸长和分裂，促进植物发芽，刺激植物生长，特别是促进开花器官的发育。渗透培养基中一些成分的毒性，往往会影响早期尚未发育成熟花的生长，降低结实率，而研究表明这部分花更容易被转化。向渗透培养基中添加GA，可以使转化后的花器官更好的发育，从而提高转化效率。