[发明专利]丙型肝炎病毒(HCV)一步荧光定量RT－PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测不同基因分型丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)血清RNA的一步荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)为黄病毒科丙型肝炎病毒属，通过血液、肾移植、静脉注射毒品、性、母婴等途径传播。HCV主要的复制部位是肝脏，慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，严重危害患者的生命健康。在被特异性检测之前，HCV一直被称为输血后非甲非乙型肝炎因子，直到1989年才应用分子克隆技术首次得以确认。HCV为单股正链RNA病毒，大小为30～38nm，有脂质包膜，目前，其复制的分子机制尚不完全清楚，对HCV引起急性肝损伤的机制也知之甚少。由于HCV感染的严格宿主限制性，仅感染人和黑猩猩，动物感染模型较难建立。在细胞培养时，变异快，病毒的产量非常低。同时HCV似乎具有很强的躲避免疫攻击的能力。因此，目前尚未能开发出有效的疫苗和治疗方案。由HCV病毒引起的肝脏疾病，在全球分布广泛，慢性丙型肝炎患者超过1.7亿，接近全球人口大得3％，许多患者长期无症状直至严重肝损害后才出现临床表现，丙型肝炎已成为威胁人类身体健康的世界性医学难题。应引起社会各界的高度重视，必须加强预防，减少发病，控制流行。

近几年的临床经验表明，干扰素对抗HCV病毒效果显著优于HBV，因此，准确检测丙型肝炎患者血清中HCV RNA的含量变化，对临床疗效的观察显得非常重要。HCV的基因组长9.4Kb，含一个大的开放阅读框(ORF)几乎占据整个基因组，其5’端为非编码序列，高度保守，因此可作为靶序列应用PCR技术扩增以检测HCV含量。

丙型肝炎病毒传统的检测方法一般为酶联免疫法(ELISA)，但该方法工作量大、耗时长，给丙型肝炎病毒的检测带来诸多不便。随着分子生物学技术的飞速发展，人们已经将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临床检验，包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测以及多种病毒、细菌耐药性的检测等。实时荧光定量PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，在一适当波长下实时在线监控反应过程，利用探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，再结合相应的软件可对结果进行分析，计算出待测样品的初始模板量。实时荧光定量PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。由于试剂盒的灵敏度问题，目前尚无法对献血员处于窗口期的HCV感染者采用PCR法检测，这是值得完善的环节。而临床所用的试剂盒大多为两步法，耗时长，不利于临床操作。

由于细胞、组织和血清中含有较难去除的RNA酶，因此HCV RNA提取的纯度对检测结果影响较大。目前常用方法有Trizol裂解法、SiO₂吸附法及纯化层析法。Trizol裂解法和SiO₂吸附法步骤烦琐，易受外界环境污染，而国外主要采用Qiagene层析柱的方法进行提取，但由于其成本太高，仅限于科研。

结合市场需求，本发明采用改进的Trizol法结合特异性硅基质核酸吸附柱来提取HCVRNA，同时，利用一步荧光定量RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取结束后直接在体系中加入RT-PCR反应液，cDNA的合成与PCR扩增反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。该操作在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间、减少了污染、降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，不仅可用于HCV定量检测，也可作为临床实验室对HCV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

发明内容