[发明专利]丙型肝炎病毒(HCV)一步荧光定量RT－PCR检测方法及其试剂盒

权利要求书

1、一种丙型肝炎病毒一步实时荧光定量RT-PCR检测方法以及试剂盒。本法考察了人体丙型肝炎病毒基因组全序列，并对检索所得HCV各个亚型序列进行同源性比较，针对其保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性荧光探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。在一适当波长下检测反应始终荧光强度，Ct值为0或大于27：丙型肝炎病毒呈阴性；Ct值小于26：则呈阳性，病人丙型肝炎病毒感染。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对丙型肝炎病毒进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。

2、本试剂盒采用改进的Trizol法结合特异性硅基质核酸吸附柱来提取HCV RNA，同时，利用一步荧光定量RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取结束后直接在体系中加入RT-PCR反应液，cDNA的合成与PCR扩增反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤。该操作在不影响灵敏度、准确度的情况下，不仅缩短了操作时间、减少了污染、降低了劳动强度，而且也直接降低了临床样品PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能，从而实现对丙型肝炎病毒的定性定量检测。按照权利要求1所述的丙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增基因序列的反应体系为：

3、丙型肝炎病毒核酸裂解液LB的配制：

异硫腈酸胍        60g

盐酸胍            20g

十二烷基肌胺酸钠  0.66g

0.5M柠檬酸钠      34ul

1M醋酸钠          122ul

Triton X-100      200ul

DEPC水定容至50mL，45℃、超声助溶，0.44um过滤除菌。加入100mL重蒸酚，调节pH至6.5。

4.漂洗液WB的配制：

含有分析纯异丙醇，需RNA专用。

5、洗脱液EB的配制：

含有pH为8.0的DEPC水。

6、一步荧光定量RT-PCR Buffer的配制：

DEPC水

Tris-HCl(pH 8.4)    30mM

KCl                 50mM

MgCl₂               2mM

甲酰胺              1.5％

DTT                 5mM

dNTP                0.5mM

PHCV1/2             各0.3pM

FPHCV               0.5pM

配制成RT-PCR反应液，每人份23.5ul，于-20℃保存。

7、丙型肝炎病毒核酸RNA的提取：

a)取血清样品100ul，加入裂解液LB 500ul，温和颠倒混匀，静置5min。

b)加入氯仿100ul，温和颠倒混匀至白色靡状液体。

c)室温离心 12,000rpm，3min。

d)在内套管中加入等体积(约250μl)漂洗液WB。小心吸取离心后的上层液体约250μl(注意不要搅动界面层)至内套管中，立即吹打混匀数次，静置2min。

e)13,000rpm离心30s，弃废液。

f)在内套管中直接加入漂洗液WB 250μl，静置1min，13,000rpm离心2min，弃废液。

g)加入500ul 75％乙醇漂洗离心柱，静置1min。

h)13,000rpm离心30s，弃废液。

i)13,000rpm离心2min。(如吸附柱内仍有残留液体，可加大转速，延长离心时间。)

j)将离心柱置于一干净无RNase污染的离心管中，并加入适量洗脱液EB，静置2min，13,000rpm离心30s，所得液体即为目的产物，可用于下一步实验。