[发明专利]大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其制备方法，本发明还涉及所述大肠杆菌乙醇发酵工程菌在发酵生产乙醇中的应用。

背景技术

在农作物秸秆和残留物中，纤维素和半纤维素的含量可占到干重的75％以上，将农作物秸秆进行发酵生产乙醇，是很好的获得乙醇的方式。

纤维素主要是由葡萄糖分子经过β-1，4糖苷键连接而成的直链分子；半纤维素是包括木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露和葡萄糖等多种糖分的非结晶异质多聚体，又以木糖的含量为最高。

大肠杆菌含有利用六碳糖和五碳糖的所有必需酶，可发酵葡萄糖、果糖等六碳糖，也可以发酵木糖、阿拉伯糖等五碳糖。但是利用野生型大肠杆菌发酵生产乙醇，在产业上并不可行，原因有二：

一是野生型大肠杆菌进行的是混合酸发酵，得到的是多种产物，乙醇在发酵产物中仅占很少一部分。

其二是野生型大肠杆菌对乙醇非常敏感。在较高浓度乙醇环境下，大肠杆菌细胞膜构成就会发生变化，生长受到抑制。如30g/L的乙醇已经明显抑制大肠杆菌生长，浓度更高时，抑制作用更明显。因此不适合进行乙醇发酵生产。

综上，将农作物秸秆进行发酵生产乙醇，并在产业可行，需要解决以上两个难题，即：对大肠杆菌的乙醇代谢途径进行改造，引入高效的乙醇发酵途径，使乙醇成为主要发酵产物；同时所述菌株必须耐高浓度的乙醇，在高乙醇浓度下仍然保持较高发酵速率。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新型大肠杆菌乙醇发酵工程菌，使其在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇转化率。

本发明用以下两种方式解决了技术问题，得到了一种新型的大肠杆菌乙醇发酵工程菌：

1、筛选得到了高耐乙醇的大肠杆菌突变株；

将大肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定向筛选后获得了乙醇耐性，得到的耐乙醇突变株可在45g/L的乙醇中生长。

2、对高耐乙醇的大肠杆菌突变株进行了基因改造。

在上述高耐乙醇的大肠杆菌突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，两个基因在可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac启动下发生共表达，得到耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。

由于引入同型乙醇发酵途径，控制其细胞内的碳代谢向生成乙醇的方向进行，使得其发酵主产物为乙醇。

本发明的大肠杆菌乙醇发酵工程菌具体的具体制备方法是：

1、利用大肠杆菌JM109菌株进行耐乙醇筛选，经过几次筛选后涂布到含有异丙醇的固体LB培养基上，挑选生长迅速的单菌落继续进行乙醇耐受培养，经过多代的定向筛选后得到可在45g/L的乙醇中生长的耐乙醇突变株ET1。

按照上述筛选过程重复进行菌株的培养和筛选，可以得到的同样的结果，即可以得到在45g/L的乙醇中生长的耐乙醇突变株。

2、将包含有SD序列的运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因经过PCR克隆后连接到pGEM-T easy载体上，经过酶切后置于含有可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体pZY507上，使得乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中发生共转录和共表达，得到大肠杆菌乙醇发酵工程菌。

经实验证实，用本发明所提供的大肠杆菌乙醇发酵工程菌在发酵五碳糖和六碳糖生产乙醇时，其发酵葡萄糖转化率达到理论产值的86％，发酵木糖的转化率达到理论产值的78％。

本发明的优点是：

1.以大肠杆菌耐乙醇突变株ET1构建乙醇发酵工程均的初发菌株，使得工程菌在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率；

2.本发明利用了含有能被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体使运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌耐乙醇突变株ET1中共同转录和表达。使得其发酵主产物为乙醇，在提高乙醇产率的同时降低了后续蒸馏过程中的投入。

具体实施方式

实施例1  耐乙醇大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备

A、大肠杆菌乙醇耐受突变株的筛选