[发明专利]大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用

权利要求书

1.一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌，其特征是在高耐乙醇的大肠杆菌突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因。

2、根据权利要求1所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备方法，其步骤如下：

1)将大肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定向筛选后获得了乙醇耐性，得到高耐乙醇的大肠杆菌突变株；

2)在上述高耐乙醇的大肠杆菌突变株中转入运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，两个基因在可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac启动下发生共表达，得到耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。

3、根据权利要求2所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备方法，所述将大肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定向筛选是：利用大肠杆菌JM109菌株进行耐乙醇筛选，经过几次筛选后涂布到含有异丙醇的固体LB培养基上，挑选生长迅速的单菌落继续进行乙醇耐受培养，经过多代的定向筛选后得到可在45g/L的乙醇中生长的耐乙醇突变株。

4、根据权利要求2所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备方法，所述转入运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因是：将包含有SD序列的运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因经过PCR克隆后连接到pGEM-T easy载体上，经过酶切后置于含有可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体pZY507上，使得乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中发生共转录和共表达。

5、用权利要求1所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇中的应用。

6、一种高耐乙醇的大肠杆菌突变株，其特征是将大肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定向筛选后获得了乙醇耐性，可在45g/L的乙醇中生长。

7、根据权利要求6所述的高耐乙醇的大肠杆菌突变株的制备方法，其特征是利用大肠杆菌JM109菌株进行耐乙醇筛选，经过几次筛选后涂布到含有异丙醇的固体LB培养基上，挑选生长迅速的单菌落继续进行乙醇耐受培养，经过多代的定向筛选后得到。