[发明专利]一种用于鉴定未知基因序列的连接片断PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，是一种利用连接片断技术和PCR(Polymerase Chain Reaction)技术，从部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列确定该DNA或基因序列两侧的未知DNA序列的方法。

背景技术

现代生物学的特点是不知道某个基因完整的DNA序列，就无法对该基因进行结构和功能的深入研究，而目前已经报道的新基因中有相当一部分只是获得了部分DNA序列。研究工作中经常碰到的问题是，要从已知的部分DNA序列出发去鉴定该基因的完整DNA序列，特别是包括各种调控元件在内的5′上游和3′下游DNA序列。现行的根据已知序列鉴定其两端未知序列方法有限，使这项工作变得繁重和棘手。随机法测序是通过大量的随机测定DNA序列，在借助计算机的力量进行排序的方法来得到所需要的DNA序列，存在很大的偶然性，通常会耗费很大的人力和物力。另外有一种方法称为RACE，该方法可以在有部分mRNA序列已知的条件下，帮助获得目标基因的完整长度的mRNA序列，但RACE不能获得一个基因的上游和下游的调控元件序列，只能获得功能基因上的编码序列。由于RACE成功的前提是mRNA反转录成cDNA序列的反应要控制的很好，但由于mRNA易于降解，反转录反应还特别容易受到丰度低和高级结构的影响。而利用同位素或生物素进行标记的探针对DNA文库进行杂交筛选的方法，则更是费时费力，为研究者在不得已的情况下的最后选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作快速简便，成本低廉，高效准确，根据部分DNA序列来确定其两侧未知DNA序列的方法。

本发明提出的根据部分DNA序列来确定其两侧未知DNA序列的方法，是通过对已知序列的限制性内切酶位点进行酶切，回收酶切产物与一段带有酶切位点的一段特定序列(S序列)进行连接。连接后产物用两套巢式特异引物来进行扩增。其中两套引物的正向巢式引物分别选取已知序列上的常见启动子序列或者终止子序列，也可以是靠近未知边界的目的基因。其中两套引物的反向巢式引物则取自只有一端又特异酶切位点的一段特定序列。使用上述引物进行PCR扩增，运用巢式引物进行PCR产物初步鉴定，最后对所得片断进行克隆和测序鉴定。其具体步骤如下：

(1)寡聚脱氧核苷酸引物设计：根据已知序列设计半巢式PCR引物，分别命名为YZ1和YZ2，长度为16-28bp，退火温度设计为60℃，YZ1比YZ2远离待测的未知序列部分，而且两者可以部分重叠或完全重叠，YZ2的3’端距离待测序列要保留50bp以上大小(见图1所示)；对于本发明引入的带有酶切位点的一段特定序列(S序列)则分别设计两套巢式引物，以酶切位点所在一段为5’端，则在5’端设计两套巢式反向引物，分别命名为SS1和SS2，长度为16-28bp(见图1所示)，退火温度设计为60℃，SS1比SS2远离待测的未知序列部分，而且两者可以部分重叠。

(2)制备带有酶切位点的一段特定序列(S序列)：经过序列比对选取了一段150bp的DNA片断作为连接片断，把其5’端正向引物加上所需要的酶切位点进行PCR扩增，扩增条件为35个循环(94℃15s，60℃30s，72℃30s)，对扩增产物进行单酶切，把酶切产物回收就制备了一段带有酶切位点的特定序列(S序列)；

(3)限制性内切酶的选择：根据已知DNA序列上的限制性内切酶酶切位点的分析，选用在从YZ1到待测的未知序列之间没有酶切位点的酶，对基因组DNA用根据上述原则确定的限制性内切酶作用0.5-20h后，纯化基因组DNA片断。如可以先用酚-氯仿去除限制性内切酶，再用乙醇沉淀的方法纯化获得的基因组片断。

本发明可选用以下两种生成同样粘端的同裂酶，分别为生成-3’粘性末端切口的Hind III，Sac I；生成-3’粘性末端切口的BamH I，Dpn I， Mbo I；

(4)PCR模板构建：运用DNA聚合酶把步骤(2)制备的带有酶切位点的特定序列(S序列)和步骤(3)制备的酶切基因组DNA片断在16℃连接4-6个小时，流程图见图1；

(5)PCR扩增：以步骤(4)中的产物为模板，以YZ1和SS1为首轮PCR扩增引物进行PCR扩增待测的未知DNA序列，取首轮扩增产物1ul作为第二轮PCR扩增产物的模板，以YZ2和SS2为引物进行PCR扩增待测的未知DNA序列；扩增产物用琼脂糖电泳鉴定，然后对所得到的片断进行克隆和测序鉴定。