[发明专利]一种用于鉴定未知基因序列的连接片断PCR检测方法

权利要求书

1.一种用于鉴定未知基因序列的连接片断PCR检测方法，其特征在于通过对已知序列的回收酶切产物与一段带有酶切位点的一段特定序列(S序列)进行连接。连接后产物用两套巢式特异引物来进行扩增。其中两套引物的正向巢式引物分别选取已知序列上的常见启动子序列或者终止子序列，也可以是靠近未知边界的目的基因。其中两套引物的反向巢式引物则取自只有一端又特异酶切位点的一段特定序列，使用上述引物进行PCR扩增，其具体步骤如下：

(1)寡聚脱氧核苷酸引物设计：根据已知序列设计半巢式PCR引物，分别命名为YZ1和YZ2，长度为16-28bp，退火温度设计为60℃，YZ1比YZ2远离待测的未知序列部分，而且两者可以部分重叠或完全重叠，YZ2的3’端距离待测序列要保留50bp以上大小；对于本发明引入的带有酶切位点的一段特定序列(S序列)则分别设计两套巢式引物，以酶切位点所在一段为5’端，则在5’端设计两套巢式反向引物，分别命名为SS1和SS2，长度为16-28bp，退火温度设计为60℃，SS1比SS2远离待测的未知序列部分，而且两者可以部分重叠。

(2)制备带有酶切位点的一段特定序列(S序列)：经过序列比对选取了一段150bp的DNA片断作为连接片断，把其5’端正向引物加上所需要的酶切位点进行PCR扩增，扩增条件为35个循环(94℃15s，60℃30s，72℃30s)，对扩增产物进行单酶切，把酶切产物回收就制备了一段带有酶切位点的特定序列(S序列)；

(3)限制性内切酶的选择：根据已知DNA序列上的限制性内切酶酶切位点的分析，选用在从YZ1到待测的未知序列之间没有酶切位点的酶，对基因组DNA用根据上述原则确定的限制性内切酶作用0.5-20h后，纯化基因组DNA片断；

(4)PCR模板构建：运用DNA聚合酶把步骤(2)制备的带有酶切位点的特定序列(S序列)和步骤(3)制备的酶切基因组DNA片断在16℃连接4-6个小时；

(5)PCR扩增：以步骤(4)中的产物为模板，以YZ1和SS1为首轮PCR扩增引物进行PCR扩增待测的未知DNA序列，取首轮扩增产物1ul作为第二轮PCR扩增产物的模板，以YZ2和SS2为引物进行PCR扩增待测的未知DNA序列；扩增产物用琼脂糖电泳鉴定，然后对所得到的片断进行克隆和测序鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于选用以下几种生成同样粘性末端的同裂酶，对基因组DNA进行酶切：生成-3’粘性末端切口的Hind III，Sac I；生成-3’粘性末端切口的BamHI，Dpn I，Mbo I；

3.根据权利要求1所述的方法，一段带有酶切位点的一段特定序列(S序列)(150bp)为：(酶切位点)5’-AGCT/5’-GATC-gacagcgtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgtaggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat

4.根据权利要求1所述的方法，使用引物对SYZ1/SS1PCR，YZ2/SS2进行PCR扩增的条件如下：10×PCR反应缓冲液5体积份、10×25mM MgCl25体积份、10mM dNTP 2体积份、Taq DNA聚合酶0.4体积份、5μM上游引物1体积份、5μM下游引物1体积份、灭菌超纯水33.6体积份、加入的模版DNA2体积份；

PCR扩增循环参数为：95℃预变性4min；94℃变性10s；60℃退火1min；72℃延伸2min，循环35次；最后在72℃延伸10min。