[发明专利]一种用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，涉及HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的评价体系，特别是涉及一种可用于NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性评价的载体及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)正严重危害着人类健康。我国HCV感染者已达6000万。HCV急性感染后50-80％转变为慢性感染，其中的10-20％发展成肝硬化，并与肝细胞癌的发生密切相关。HCV为单股正链RNA病毒，属黄病毒科，全长约9600个核苷酸，ORF区编码3010个氨基酸的多聚蛋白前体，经过宿主和病毒本身基因编码的蛋白酶裂解为十个功能性片段，包括4个结构蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2以及P7)及6个非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)，如图1所示。

HCV NS3/4A蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性，参与病毒蛋白翻译后加工，在NS4A的辅助下能催化裂解NS3-NS4A，NS4A-NS4B，NS4B-NS5A和NS5A-NS5B的连接点，对HCV非结构蛋白的成熟起到关键作用。因此，抑制HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性，可阻止HCV非结构蛋白的成熟。HCV NS3/4A抑制剂，可成为抗丙型肝炎病毒药物。

多年来针对HCV NS3/4A抑制剂的研究取得可喜的进展，但由于缺乏理想的评价体系，这些药物抗HCV的作用效果难以作出评估，极大地延缓了这些药物进入临床，因而建立一种理想的适用于HCV NS3/4A蛋白抑制剂筛选及评价体系迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白。

该用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白，由细胞内定位因子-NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物-报告基因SEAP组成的融合基因插入真核表达载体形成指示载体后表达产生。

所述细胞内定位因子为EGFP、Fluc、RFP、或所有定位于细胞内且不影响细胞功能的蛋白分子；所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS3/NS4A、NS4A/4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B的连接点。

指示载体的表达在体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动物体内表达。

所述融合蛋白为EGFP-NS4A/4B-SEAP，是融合基因EGFP-NS4A/4B-SEAP插入真核表达载体PCI neo形成指示载体EGFP(Δ4AB)SEAP后表达产生。

编码上述融合蛋白的融合基因也是本发明所要提供的。具体的，所述融合基因，表示为EGFP-NS4A/4B-SEAP，其核苷酸序列如SEQ.1所述。

由上述融合基因插入真核表达载体构建而成的指示载体也是本发明所要提供的。具体的，所述指示载体，是融合基因EGFP-NS4A/4B-SEAP插入真核表达载体PCIneo形成，表示为EGFP(Δ4AB)SEAP。

本发明的另一目的是提供一种评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的方法，即所述融合蛋白在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选与评价中的应用。

具体的，该应用是在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂存在的条件下，用上述指示载体转染含有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的细胞，收集细胞培养上清，测定胞外SEAP活性，以此测定细胞内HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的抑制率，得到对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂效果的评价。

所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶和指示载体可以在不同载体中表达，或以双顺反子的形式在同一载体中表达。

所述双顺反子，NS3/4A基因位于融合基因EGFP-NS4A/4B-SEAP之后，由HCVIRES介导其翻译表达，可同时评价HCV IRES的功能。

具体的，用所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶构建表达载体pEGFP-N1-NS3/4A，用pEGFP-N1-NS3/4A载体转染细胞后，再以指示载体EGFP(Δ4AB)SEAP转染细胞；或用所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶构建表达载体pEGFP-N1-NS3/4A，用pEGFP-N1-NS3/4A载体和指示载体EGFP(Δ4AB)SEAP共转染细胞。

在应用中，所述细胞为体外细胞或体内细胞，所述NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂主要包括干扰RNA、小分子化合物、或多肽。

利用本发明提供的融合蛋白，不仅可简单、快速、灵敏而且可以定量指示丝氨酸蛋白酶活性，具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为HCV的基因结构模式图。