[发明专利]一种用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的融合蛋白及其应用

权利要求书

1.用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白，由细胞内定位因子-NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物-报告基因SEAP组成的融合基因插入真核表达载体形成指示载体后表达产生。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述细胞内定位因子为EGFP、Fluc、RFP、或所有定位于细胞内且不影响细胞功能的蛋白分子；所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS3/NS4A、NS4A/4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B的连接点。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：指示载体的表达在体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动物体内表达。

4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为EGFP-NS4A/4B-SEAP，是融合基因EGFP-NS4A/4B-SEAP插入真核表达载体PCI neo形成指示载体EGFP(Δ4AB)SEAP后表达产生。

5.编码权利要求1至4任一所述融合蛋白的融合基因。

6.根据权利要求5所述融合基因，其特征在于，表示为EGFP-NS4A/4B-SEAP，其核苷酸序列如SEQ.1所述。

7.指示载体，由权利要求5或6所述融合基因插入真核表达载体构建而成。

8.根据权利要求7所述指示载体，其特征在于，是融合基因EGFP-NS4A/4B-SEAP插入真核表达载体PCI neo形成，表示为EGFP(Δ4AB)SEAP。

9.权利要求1至4任一所述融合蛋白在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选与评价中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂存在的条件下，用权利要求7或8所述指示载体转染含有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的细胞，收集细胞培养上清，测定胞外SEAP活性，以此测定细胞内HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的抑制率，得到对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂效果的评价。

11.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶和指示载体在不同载体中表达，或以双顺反子的形式在同一载体中表达。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述双顺反子，NS3/4A基因位于融合基因EGFP-NS4A/4B-SEAP之后，由HCV IRES介导其翻译表达，可同时评价HCV IRES的功能。

13.根据权利要求10所述应用，其特征在于，用所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶构建表达载体pEGFP-N1-NS3/4A，用pEGFP-N1-NS3/4A载体转染细胞后，再以指示载体EGFP(Δ4AB)SEAP转染细胞。

14.根据权利要求10所述应用，其特征在于，用所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶构建表达载体pEGFP-N1-NS3/4A，用pEGFP-N1-NS3/4A载体和指示载体EGFP(Δ4AB)SEAP共转染细胞。

15.根据权利要求10至14任一所述应用，其特征在于，所述细胞为体外细胞或体内细胞。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂主要包括干扰RNA、小分子化合物、或多肽。