[发明专利]一种高通量寡核苷酸测序方法

说明书

发明领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高通量寡核苷酸测序方法。

背景技术

随着已完成测序的基因组数量的增加，需要分析基因组序列所编码的大量信 息以及由这些散布于基因组中的不同序列元件控制及参与的生物功能。然而，这 比基因组测序更具复杂性，需要能处理大量参数及不同条件下(包括正常条件及 非正常条件下)过程的有力工具及方法。只有这种综合性的研究方法才可能使我 们了解到生物学的多数基本原理，这样的研究也会带来造福人类的重大技术进 展。

功能基因组研究中发展起来的一项主要的方法，是通过用不同手段分离得到 DNA序列并进行定量分析，而这些序列在基因组中的定位常常对其中包含的一 些元件的功能具有决定性的指示作用。例如，DNA结合蛋白的结合位点可以很 方便地用高特异抗体用ChIP(Chromatin Immunoprecipitation，染色体免疫共沉 淀)的方法分离出来，而它们在染色体中所处的位置可以揭示关键基因的调控以 及不同转录因子的协同作用。又如测定mRNA对整个基因组的相对丰度，不仅 反映细胞或组织的状态，也能反映对癌症或其他疾病的诊断具有关键性作用的标 识物。某些此类标识物基因可成为未来开发药物的靶位点。尽管这些研究对生物 学的推动力可能各不相同，且涉及基础研究至药物研发等一系列领域，但基本的 衡量方式是一致的。

迄今为止，寡核苷酸阵列已成为这项研究中最为广泛使用的有效技术。在一 个表面固定上代表基因组序列不同区域的寡核苷酸，例如一个基因中的寡核苷 酸，按比例的杂交能够显示目标序列的相对丰度。寡核苷酸阵列的主要优势是相 对便捷的操作，且具有能够进行大量平行操作的能力。而进行高通量操作的能力 对新兴领域如系统生物学与系统生物医学具有至关重要的意义。

如今最常用的DNA测序方法是链终止法，例如Sanger测序法及其类似方法 所采用的双脱氧核苷酸介导的链终止法。该方法已由Sanger等人发表在美国Proc. Nat.Acad.Sci.杂志1977年第74期第5463-5467页。这种方法多数是按逐个碱 基产生数据。以DNA测序为目的的新的PCR核酸外切酶消化法也已经建立起来， 该方法由Porter发表在Nucleic Acids Research杂志1997年第25卷第8期第 1611-1617页上。这些方法通常在扩增并以独立的反应测序之前，需要一个克隆 步骤以分开单个序列，这一步需要花费大量的时间，因此大大增加了这种方法的 成本，且难以提高通量。为了测定人类基因组的序列，最先进的Sanger测序法 仍然需要花上数千万美元和几个月的时间。人们迫切需要一种新的改进的测序方 法，尤其是那种能够利用高通量、低成本系统的方法。

最近基于连接的测序技术，诸如MPSS(massively parallel signalure sequencing，大规模平行测序技术)，以及聚合酶克隆测序法的发展，能够同时测 定多达数百万DNA短标签的序列。为高通量测序指出了一个新的方向。这些不 同的基于连接酶的DNA测序方法能够被用来对通过以上描述方法构建得到的单 克隆DNA阵列进行平行测序，然而，测序的成本对于测序技术在基因组水平上 的应用仍然是巨大的障碍。

现有技术存在的问题是，尽管寡核苷酸阵列已对功能基因组学和系统生物学 的进展做出了巨大的贡献，但该技术仍存在根本性的局限。人们遇到最多的问题 是交叉杂交现象，它会产生对探针中很大片段的虚假和错误的检测。这并非是一 个容易解决的问题，尤其当杂交目标高度复杂时，例如它可能几乎囊括了整个基 因组，其相对丰度处于一个很宽的区间内。如图1所示，即使DNA序列特异片 段的融解跃变曲线十分陡峭，跨越几个量度，这也需要序列中的大量碱基来充分 地改变跃迁温度，DNA融解的陡峭跃迁。不过，Tm值在大部分情况下只微弱地 取决于序列。因此，杂交仅仅在很小的温度范围内是可区别的，这就是许多PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)实验需要仔细调节退火温度来 应对实验时所遇到的情况，从而保证试验成功。这对寡核苷酸阵列的设计提出了 巨大的挑战，人们设计的所有探针对一种普通突变片段都必须足够特异并能精确 地维持Tm。因此，给定长度在特定融解温度下的特异探针的数目是有限的，由 于计算能力的有限对较长的寡核苷酸(如大基因组所要求的)的设计就尤为困难， 而差异标识的表面效应，就使得问题更为复杂。