[发明专利]一种高通量寡核苷酸测序方法

权利要求书

1.一种高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤： 

(1)短DNA标签的生成； 

(2)DNA单分子PCR扩增标签序列：使作为PCR引物对的寡核苷酸引物通过5’端固定于经修饰的固相表面；然后将一带有规则排列的皮升级反应室的由软性物质制成的罩具压覆在固相表面，所述罩具作为含有单分子DNA的单独PCR反应室之间的分隔物；进而将每个DNA分子单独扩增，扩增后的PCR产物在PCR后期被结合到所述固相表面上，形成结合于固相表面的可用于测序的DNA分子，从而形成特定排列的短标签序列，得一个可寻址的DNA点阵列； 

(3)高密度DNA标签的富集； 

(4)利用高密度DNA标签进行大规模循环平行测序。 

2.根据权利要求1所述的高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述步骤(1)中短DNA标签的生成方法为： 

将DNA模板处理成合适长度的DNA片段； 

在所述DNA片段的两端分别添加一接头序列，得到一个末端带有通用引物序列的短DNA标签文库。 

3.根据权利要求2所述的高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述将DNA模板处理成合适长度的DNA片段的过程包括： 

对于较长的DNA片段的制备品，采用随机剪切方式使其长度减小到数百碱基对的范围内；和/或 

对于mRNA转化后得到的DNA，选择限制酶位点将所述DNA切割成具有粘性末端的短片段。 

4.根据权利要求1所述的高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述罩具的制作方式为： 

使用软性平版印刷术制造软材料膜面，形成带有规则排列的皮升级反应室的由软性物质制成的罩具。 

5.根据权利要求1所述的高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述高密度DNA标签的富集的过程包括： 

通过预先制备表面固定的引物，将所述单独扩增的序列孤立地分布在平表面的DNA上；或 

当DNA固定在微珠上时，通过扩增后的微珠富集密排并共价固定连接在平面上。 

6.根据权利要求5所述的高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述将单独扩增的序列孤立地分布在平表面的DNA的过程是： 

通过预先制备在表面固定的单独孤立带有引物的点阵，将一端或两端的PCR引物通过其5’端固定在表面上作为扩增的引物； 

对标签序列进行单独PCR扩增，形成孤立地分布在一块平表面的DNA点阵，每个点阵包含同一标签DNA序列的一个或两个单链序列，测序反应能够从标签的两端分别进行； 

而在每个标签位点序列已经得到后，用这些表面固定有DNA的模板的点阵当作DNA序列阵列，并将其用于其它样本材料的识别和分析。 

7.根据权利要求5所述的高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述微 珠富集密排并共价固定连接在平面上的过程包括： 

采用胺或者羧基修饰的表面玻璃或表面聚苯乙烯； 

对于在微珠上的DNA的端点，通过相异或者相同双功能共价固定连接元进行胺修饰，而其中共价固定连接元的顶端包括碳化二亚胺、羟甲基磷、酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰胺脂、苯基砜基酰胺脂、羟基族、以肼和醛产生的稳定的腙或以肼和酮产生的稳定的腙；或 

使用末端脱氧核苷酸转移酶在结合在微珠上的DNA末端加上踪胺修饰的核苷酸，用修饰了的微珠上的DNA端和经过修饰的胺表面进行共价固定连接。 

8.根据权利要求1所述的高通量寡核苷酸测序方法，其特征在于，所述步骤(4)中大规模循环平行测序的方法为： 

利用络合为基础的测序；或 

利用聚合酶碱基特异性来选择性延伸合成为基础的测序。