[发明专利]鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物疫病快速诊断及疫苗免疫水平的监测。通过ELISA方法建立鉴别猪口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)疫苗免疫动物与野毒感染动物的同时检测技术，并确定该疫苗免疫后血清中特异性抗体的水平。

背景技术

FMD是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一种偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病。该病在世界各地分布范围广，传播迅速，发病率极高。该病的爆发与流行不仅直接危害动物生产，而且引致的国际贸易屏障造成的损失更是不可估量。口蹄疫病毒有7个血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3与Asia1，各型间无交叉保护作用，我国以O型为主。口蹄疫在临床上难以与猪水疱病、水疱性口炎、水疱疹区分。因此，口蹄疫的实验室诊断十分重要。

由于担心疫苗毒株的扩散，现在基本上不采用口蹄疫弱毒疫苗进行群体免疫，而是采用灭活苗。由于疫苗免疫原性和动物个体差异等因素，即使是免疫动物在接触新病毒后，也可形成隐性感染而持续带毒。发达国家往往通过扑杀感染动物和可疑畜群来控制和消灭本病，而大多数发展中国家主要通过注射灭活疫苗来控制该病流行。在采取扑杀政策的国家如何检测隐性感染动物、在注射疫苗国家如何区分自然感染动物和免疫动物一直是控制和消灭口蹄疫的重要论题。因此，建立一种区分免疫动物和感染动物，或检测隐性感染动物的诊断方法就成为口蹄疫防制技术的关键。

免疫动物与感染动物均能产生针对结构蛋白抗体。因此单独检测结构蛋白抗体不能区分免疫动物与感染动物。病毒感染后复制时能产生一些具有免疫原性的非结构蛋白，而传统的口蹄疫疫苗由纯化的灭活病毒粒子组成，只存在微量的非结构蛋白。因此，检测非结构蛋白抗体能够区分感染与免疫动物。近年来，国内外有学者利用这一特征，建立了针对FMD病毒非结构蛋白抗体的ELISA检测方法。

但到目前为止，未见本研究中选用的以FMDV非结构蛋白3ABC线性抗原表位的重组蛋白及结构蛋白VP1抗原串联表位的突变蛋白表达产物为抗原进行ELISA检测的方法，也未见用结构蛋白和非结构蛋白同时快速鉴别检测猪口蹄疫疫苗抗体与野毒感染的ELISA试剂盒。

发明内容

本发明的目的是通过ELISA方法建立鉴别猪口蹄疫(FMDV)疫苗免疫动物与野毒感染动物的同时检测技术，同时可检测该疫苗免疫后血清中特异性抗体的水平。

本发明通过对FMDV非结构蛋白3ABC和O型与Asia1型VP1序列分析，确定包含所有3ABC线性抗原表位的片段139-924nt序列(47-308aa)及VP1截短、串联和定点突变的目的基因克隆入原核表达载体pET32c，得到重组质粒，转化宿主菌并经IPTG诱导蛋白表达，表达产物经提取和纯化后作为诊断抗原。

本发明鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA检测试剂盒包括两块96孔板，标号为A、B、C、D、E、F、G的7瓶溶液，48个Eppordorf管和加样及检测步骤说明书，其中溶液A为猪口蹄疫(FMDV)标准阳性血清，即一抗25μL；溶液B为阴性血清25μL；溶液C为HRP标记的兔抗猪IgG血清，即二抗12μL；溶液D为一抗及二抗的稀释液45mL；溶液E为显色液25mL；溶液F为终止液12mL；溶液G为洗涤缓冲液500mL；两块96孔板其一包被FMDV非结构蛋白3ABC所有线性抗原表位的蛋白NS-AGD纯化产物，其二包被具有较广抗原谱的结构蛋白VP1突变蛋白CHA/99纯化产物。可同时检测46份血清样品。

以上所述鉴别猪口蹄疫免疫动物与感染动物的ELISA试剂盒其检测方法为如下步骤：

(1)将10μL待检血清加入到900μL溶液D中进行100倍稀释，阳性血清和阴性血清分别取20μL，加入到800μL溶液D中进行100倍稀释，稀释在Eppordorf管中进行，充分混匀；

(2)两个96孔板中相应位置分别加入稀释的待检血清、阳性对照和阴性对照各100μL，置于湿盒中37℃作用1h；

(3)每孔加200μL溶液G进行洗涤，每次洗涤5分钟，共洗涤6次，在微量振荡器中进行；

(4)将10μL溶液C加入25mL溶液D中进行2500倍稀释，充分混匀后取100μL加入96孔板各孔中，置于湿盒中37℃温育45min；

(5)重复步骤3；

(6)每孔避光加入溶液E 100μL，37℃湿盒作用10min；

(7)每孔加入溶液F 50μL终止反应，测定OD492；