[发明专利]一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及液相色谱柱的制备，具体地说是一种新型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法。

背景技术

分子印迹(molecular imprinting)是近年来基于分子识别机理发展起来的一种对特定分子(模板分子或印迹分子)具有选择性的聚合物合成技术。通常被描述为制造识别“分子钥匙”的人工“锁”的技术。例如在非共价型分子印迹中通常以目标分子为模板，通过氢键、静电作用、疏水作用等作用，将该分子与可聚合的功能单体进行组装，并于交联剂发生聚合反应。反应结束后除去印迹分子，即可在聚合物中形成功能基团精确排布的孔穴。该孔穴与印迹分子的形状、大小、电荷分布具有互补性。因此，制备的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)对印迹分子具有良好的选择性。目前，以小分子为印迹分子制备的MIP已广泛应用于色谱填料、人工受体、模拟酶、催化剂以及传感器等领域。

然而，由于该方法本身的局限性，MIP面临的主要挑战之一是以蛋白质为模板制备蛋白质分子印迹整体柱。这是由于蛋白质体积大，将其包裹在聚合物网络中后难以洗脱出来。此外，在反应过程中还必须保持蛋白质的构象。

目前，蛋白质分子印迹聚合物的制备方法主要有包埋法、表面印迹法和抗原决定基法。包埋法也称本体聚合法，是将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按照一定比例溶解在适当的溶剂中后，通过脱气、除氧，经引发聚合制备印迹聚合物。Liao等以血红蛋白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶为模板分子，以丙烯酰胺为功能单体合成了低交联度的丙烯酰胺凝胶。然而制备的聚合物交联度低，机械强度差。部分模板分子由于被包埋在颗粒内洗脱困难。此外，吸附所需的平衡时间也较长(Liao，J.L.，Wang，Y.，Hjertén，S.，Chromatographia 1996，42，259-262；Hjertén，S.，Liao，J.L.，Nakazato，K.，Wang，Y.et al.，Chromatographia 1997，44，227-234)。采用表面印迹技术可将模扳分子的识别位点置于颗粒表面，能克服本体聚合的弊端。通常是在微球或聚合物涂层上进行印迹。Glud将转铁蛋白在溶液中与硼酸酯硅烷发生作用，然后在多孔硅胶颗粒上进行聚合。由于硼酸酯基团能与转铁蛋白上的硅酸铝发生不可逆反应，因此硼酸酯硅烷与转铁蛋白的预结合使得硼酸酯基团能正确排列，确保了与转铁蛋白的特异性相互作用(Glad M，Norrlw O，Sellergren B，Siegbahn N，Mosbach K。J.Chromatogr.1985，347，11-23.)。但是这种方法制备的印迹聚合物吸附容量比较低，制备过程繁琐。Shi等先将蛋白质吸附在云母表面，再将二糖分子薄层覆盖在吸附的蛋白质上。随后将含氟聚合物薄膜通过射频发光放电等离子体与糖分子交联。去除云母并洗脱蛋白质分子后即可在聚合物薄膜表面形成多糖覆盖的蛋白质印迹纳米孔穴。该材料对二元蛋白质溶液中的模板蛋白质具有一定的选择性吸附。但由于聚合物的表面积所限，此项技术只能用于蛋白质的检测，不适于对蛋白质进行识别分离(Shi H.，Tsai W.B.，Garrison M.D.，Ferrari S.，Ratner B.D.，Nature 1999，398，593-597.)。抗原决定基法的原理是抗体在识别抗原时，只与抗原的决定基作用。因此具有相同决定基的抗原可以被同一种抗体识别。以代表蛋白质或多肽结构的小部分裸露片断的短肽作为模板，形成与之匹配的空间孔穴，即可识别多种具有该肽段的分子(Rachkov A.，Minoura N.；Biochimica et Biophysica Acta1544(2001)255-266)。该方法的缺点是选择性较差。印迹聚合物不仅可以识别模板分子，而且可以识别与模板具有相同氨基酸序列的多肽或蛋白质。

综上所述，目前已有的蛋白质印迹技术仅限于合成聚合物颗粒。其蛋白质模板分子包埋严重，选择性差，无法对蛋白质进行识别分离。因此均不适于制备蛋白质印迹整体柱。

发明内容