[发明专利]棘皮动物活体取样提取DNA的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种棘皮动物提取DNA的方法，尤其是一种棘皮动物活体取样提取DNA的方法。

背景技术：

目前，动物的DNA提取技术已在遗传育种、实验研究以及生产检测中普遍应用，基本方法是从动物体(活体、死体)上取下部分组织样品，将样品在裂解液中充分剪碎或匀浆，并使样品组织充分消化，然后再经过萃取、离心取上清液、乙醇沉淀、离心分离、检测等步骤，而其中的活体取样更利于遗传育种、养殖状况监测、基因筛选、家系鉴别等研究。海洋动物中有部分可以实现活体取样，例如鱼类，可以抽血、剪鳍条等，但是，对于棘皮动物(海胆、海参)却很难实现。由于海胆表面有壳和棘覆盖、海参表面主要是胶原蛋白和多糖，都很难获取到含有基因组DNA的细胞，因而传统的棘皮动物DNA提取方法需要将试验动物杀死，而后选用齿间肌(海胆)、纵肌(海参)等组织取样，即在死体上取样。这种取样方法所获得的遗传信息在育种上没有实际意义，对棘皮动物遗传育种工作的开展极为不利。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种可以合理利用棘皮动物资源，进行辅助育种、养殖状况监测、基因筛选、家系鉴别等研究工作的棘皮动物活体取样提取DNA的方法。

本发明的技术解决方案是：一种棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其步骤如下：

a.取棘皮动物活体组织至少0.01g，放入离心管中；

b.在盛有棘皮动物样品组织的离心管中，加入200μl裂解液，然后将组织在裂解液中充分剪碎，50℃消化45～55min，期间每隔10min振荡摇匀一次，所述裂解液的组分及终浓度为0.2g/l蛋白酶K，0.5％SDS，100mmol/l EDTA，0.05g/lRNA酶；

c.在离心管中加入200μl TES稀释溶液稀释；

d.加入200μl的Tris-饱和平衡酚和200μl氯仿-异戊醇混合液，萃取15～30min；

e.7500r/min离心10min，用粗口枪头移液器抽取上清，将上清液置入另一离心管中；

f.重复d、e步骤；

g.将萃取之后的上清夜在10000r/min离心10min，使用粗口枪头移液器吸取溶液，放入另一离心管中；

h.在离心管中，加入两倍于离心管中体积的100％的-20℃乙醇，之后放入-20℃中静置至少4h；

i.12500r/min离心15min，除去溶液，将离心管倒置在滤纸上，吸干剩液；

j.向离心管中加入70％乙醇800μl，洗涤一次，12500r/min离心5min，倒掉溶液，室温晾干至少30min；

k.加入0.1×TE 100μl，轻轻振荡，然后4℃溶解至少4h；

l.用1％的琼脂糖凝胶电泳，取2μl DNA模板混合2μl上样缓冲液在琼脂糖胶上点样进行检测，电泳结果经凝胶成像显示DNA的浓度与质量。

所述a步骤是将活海胆或活海参放在盛有海水的容器中，海水的深度刚没过海胆或海参，用剪刀剪取海胆管足或海参的触手、管足，放在滤纸上吸干水分。

为防止感染，最好在所述海水中以0.001g/l的剂量加入青霉素。

所述a步骤是将促使活海参排出内脏；将海参吐出的肠剖开用双蒸水冲洗干净，然后将洗净的海参肠放在滤纸上吸干水分。

所述的促使活海参排出内脏是向海参体内注射淡水或注射0.35mol/l的KCl2～4ml。

所述f步骤后观察中间层和下层，如有中间层或下层颜色深，加入400μL氯仿-异戊醇再萃取一次。

本发明可无需将棘皮动物杀死，而是在活体上取样，继而提取DNA，使分子生物学技术能真正成为遗传育种的辅助工具。利用本发明，可以合理利用棘皮动物资源，进行辅助育种、养殖状况监测、基因筛选、家系鉴别等工作。另外，对于棘皮动物中很多濒危种的保护和研究，意义也十分重大。

具体实施方式：

实施例1：

a.将活海胆放在盛有少量海水的容器中，海水的深度以刚没过海胆为宜，这样，可让海胆管足在水中呈放射状向外伸出，方便取样；用剪刀剪取少量海胆管足(根据实际情况大约能够获得约1～3mm长的管足不等)，放在滤纸上吸干水分；称量所取海胆管足质量，取样量最少不得少于0.01g，放入1.5ml离心管中；