[发明专利]棘皮动物活体取样提取DNA的方法

权利要求书

1.一种棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其步骤如下：

a.取棘皮动物活体组织至少0.01g，放入离心管中；

b.在盛有棘皮动物样品组织的离心管中，加入200μl裂解液，然后将组织在裂解液中充分剪碎，50℃消化45～55min，期间每隔10min振荡摇匀一次，所述裂解液的组分及终浓度为0.2g/l蛋白酶K，0.5％SDS，100mmol/l EDTA，0.05g/lRNA酶；

c.在离心管中加入200μl TES稀释溶液稀释；

d.加入200μl的Tris-饱和平衡酚和200μl氯仿-异戊醇混合液，萃取15～30min；

e.7500r/min离心10min，用粗口枪头移液器抽取上清，将上清液置入另一离心管中；

f.重复d、e步骤；

g.将萃取之后的上清夜在10000r/min离心10min，使用粗口枪头移液器吸取溶液，放入另一离心管中；

h.在离心管中，加入两倍于离心管中体积的100％的-20℃乙醇，之后放入-20℃中静置至少4h；

i.12500r/min离心15min，除去溶液，将离心管倒置在滤纸上，吸干剩液；

j.向离心管中加入70％乙醇800μl，洗涤一次，12500r/min离心5min，倒掉溶液，室温晾干至少30min；

k.加入0.1×TE 100μl，轻轻振荡，然后4℃溶解至少4h；

l.用1％的琼脂糖凝胶电泳，取2μl DNA模板混合2μl上样缓冲液在琼脂糖胶上点样进行检测。

2.根据权利要求1所述的棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其特征在于：所述a步骤是将活海胆或活海参放在盛有海水的容器中，海水的深度刚没过海胆或海参，用剪刀剪取海胆管足或海参的触手、管足，放在滤纸上吸干水分。

3.根据权利要求2所述的棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其特征在于：在所述海水中以0.001g/l的剂量加入青霉素。

4.根据权利要求1所述的棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其特征在于：所述a步骤是促使活海参排出内脏；将海参吐出的肠剖开用双蒸水冲洗干净，然后将洗净的海参肠放在滤纸上吸干水分。

5.根据权利要求4所述的棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其特征在于：所述的促使活海参排出内脏是向海参体内注射淡水或注射0.35mol/l的KCl2～4ml。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其特征在于：所述f步骤后观察中间层和下层，如有中间层或下层颜色深，加入400μl氯仿-异戊醇再萃取一次。