[发明专利]三七原人参二醇型皂苷制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属中药提取物，涉及从中药三七中提取的二醇式达玛烷型四环三萜类皂苷提取物，该提取物具有抑制血管生成的作用，可用于恶性实体瘤的防治。

技术背景

肿瘤的大小超过0.2mm时，开始建立自身的血液供应系统，即新的血管生成(angiogenesis)。血管生产是生长出新的微细血管，这个过程主要依赖毛细血管内皮细胞的迁移、增殖和管腔形成。在正常生理条件下，血管生成严格受控于内源性血管生成因子与抗血管生成因子二者之间的平衡；而肿瘤的“血管生成启动”是以癌基因激活肿瘤表达血管生成因子的前体蛋白为特征的，包括VEGF、bFGF、IL-8、PDGF等等，与肿瘤缺氧相关的缺氧条件也能激活缺氧诱导因子HIF-1α，后者能诱导血管生成因子的上调。

异常的血管生成是肿瘤的一个显著特征。常规的抗肿瘤药物常因耐药性使其疗效收到一定限制，而且往往带来严重的毒副作用，抗血管生成的药物能够克服这些抗肿瘤药物的弊端，抑制肿瘤新的血管形成可使肿瘤细胞的营养不足，限制肿瘤的快速生长。因此可以用于抗肿瘤治疗。

作为一类靶向抗肿瘤药物，血管生成抑制剂的研究与开发在世界范围内受到广泛关注。当前，全球至少有30多种血管生成抑制剂已经进入临床研究，其中恩度(Endostatin)、阿瓦斯汀(Avastin)等已经批准上市，取得了一定的治疗效果。但是，这类药物往往需要采取注射给药方式，且储存和运输条件苛刻。同时，这些药物价格通常相当昂贵，患者的经济负担很沉重。因此，需要继续开发疗效确切、使用方便、价格低廉的血管生成抑制剂。

三七为五加科(Araliaceae)多年生草本植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的根，主产于云南、广西及四川等地。三七总皂苷(Panax notoginoside，PNS)是三七主要活性成分，其含量约10％左右。其主要活性成分是达玛烷型20(S)-原人参二醇型(ppd)和20(S)-原人参三醇型(ppt)四环三萜皂苷，二者区别在于原人参二醇型皂苷B环6位无羟基取代而原人参三醇型B环有一羟基取代。三七中原人参二醇型皂苷主要包括人参皂苷Rb₁和Rd，原人参三醇型皂苷主要包括人参皂苷Re和Rg₁，三七皂苷R₁等。

虽然有许多三七及其成分抗肿瘤的报道，但一般认为，主要是通过调节机体免疫功能，改善生理机能发挥作用的。另外，三七皂苷及其相关的化学物质对于多种化疗导致的毒副作用具有减轻或拮抗的作用。此前，各项研究均未将三七中原人参二醇型和原人参三醇型皂苷分开进行生物活性研究。

发明内容

本发明的目的是提供来源于五加科植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的三七原人参二醇型皂苷制备方法，用本发明方法制备获得的提取物主要含有达玛烷型四环三萜类原人参二醇型皂苷类提取物，其活性组成包括人参皂苷Rb₁和Rd等，其活性组成人参皂苷Rb₁和Rd在提取物中含量不低于60％，提取物中还含原人参三醇型皂苷，其人参皂苷Re、Rg₁和三七皂苷R₁总含量不高于5％。所有含量用HPLC法，外标法测定。

本发明通过以下步骤实现：

(1)用含水乙醇作为溶剂对三七进行提取；

(2)提取液经过色谱柱层析得洗脱液；

(3)用反相液相色谱梯度洗脱，收集洗脱液经浓缩得到目的提取物。

其中步骤(1)中三七药材粉碎为粉末(过20目筛)至粗颗粒(粒径约1cm)状，提取液乙醇浓度为0-95％，溶剂用量5-20倍量，加热提取1-3次，每次0.5-2小时，最佳工艺为药材粉碎至颗粒状(3mm-8mm)，70％乙醇10-12倍溶剂量提取2次，每次2小时。

步骤(2)具体为样品上树脂后，先用水冲洗3-6个柱体积(BV)，再用0.05％-3％氨水冲洗3-6BV，再用水冲洗至pH＝7，用20-50％乙醇洗脱4-8BV，最后用30-80％乙醇洗脱4-8BV，收集最后洗脱液，浓缩，干燥。最优步骤为以大孔树脂D101为载体上样，先用水冲洗4-5个柱体积(BV)，再用0.05-0.1％氨水冲洗4-5BV，再用水冲洗至pH＝7，再用40％乙醇冲洗4-5BV，最后用70％乙醇洗脱5-6BV，收集洗脱液，浓缩，干燥。