[发明专利]分离编码具有酯酶活性的蛋白的DNA的方法

说明书

本案为分案申请，母案的国际申请日为1997年9月29日，申请号为97199664.4，国际申请号为PCT/US97/17614，母案的发明名称为“酯酶及其编码DNA和掺入此DNA的载体和宿主细胞”。

发明背景

本发明涉及新的酯水解酶、编码此酶的新遗传物质和从其产生的酯水解蛋白。本发明特别提供来自曲霉属的酯酶、编码此酯酶的DNA，含此DNA的载体、用此DNA转化的宿主细胞和此宿主细胞产生的蛋白产物。

木聚糖是自然界中仅次于纤维素的最丰富的可更新多糖。它是植物中主要的半纤维素成分并主要位于被子植物和裸子植物的次生细胞壁中。木聚糖的成分和结构比纤维素更复杂并且在不同的木本植物种类、草类和谷类中数量和质量不同。木聚糖是杂聚合物，其中各成分不仅通过糖苷键连接而且通过酯键连接。阿魏酸是在植物中发现的最丰富的羟基桂皮酸并已知在小麦麦麸、小麦粉、大麦杆、玉米、甘蔗渣、稻草和其它单子叶植物中酯化成阿拉伯糖，并也发现在甜菜、菠菜和其它双子叶植物的果胶中酯化成半乳糖残基。在单子叶植物中p-香豆酸也以相似方式连接。已表明这些酚酸可以减少细胞壁的生物降解并在细胞壁延伸及通过植物过氧化酶形成酚二聚体和/或通过阳光启动光二聚化作用来稳定交叉连接的杂木聚糖链中起重要作用。此外，已表明酚酸作用为细胞壁多糖和苯丙酸木质素多聚体间的交叉连接。木质素与壁多糖的共价连接及半纤维素内木聚糖链的交叉连接限制了多糖的总生物利用率，导致动物饲料中大量的未消化纤维、农业废物向有用产品的生物转化低及谷物的不完全加工。

将木聚糖酶水解成单体需要几种不同功能的酶参与。根据酶切割连接键的性质可将这些酶分为两类。第一类酶是参与木聚糖糖苷键水解作用的水解酶(EC 3.2.1)。这些酶包括将木聚糖主链随机切割成短木寡糖的内木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；以外方式切割木寡糖产生木糖的木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；α-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；以及从木聚糖主链中分别去除阿拉伯糖和4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基的α-glucoronidase(EC 3.2.1.1)。第二类酶包括水解木聚糖多聚体的木糖单位之间的酯键(酯酶EC 3.1.1)和酰基(酰基木聚糖酯酶EC3.1.1.6)或阿拉伯糖基和诸如阿魏酸(阿魏酸酯酶)和p-香豆酸(香豆酸酯酶)的酚基之间的酯键的酶。

Faulds等报道了从黑曲霉分离的两种形式的阿魏酸酯酶。根据分子量和底物特异性来辨别这些不同的酯酶[Faulds等，生物技术和应用生物化学，第17卷，第349-359页(1993)]。Brezillon等公开了认为不同于现有技术证明的阿魏酸酯酶的至少两种肉桂酸酯酶[Brezillon等，应用微生物生物技术，第45卷，第371-376页(1996)]。从黑曲霉CBS 120.49中分离出称为FAE-III的阿魏酸酯酶并表明此酶与木聚糖酶一起作用以除去小麦麦麸制品中几乎所有的阿魏酸和低分子量木寡糖；在不加木聚糖酶时也可除去阿魏酸，但是低水平的。Faulds等进一步从在燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖上生长的黑曲霉CBS120.49分离并部分鉴定了FAE-III[Faulds等，微生物，第140卷，第779-787页(1994)]并表明FAE-III的pI为3.3，分子量为36kD(SDS-PAGE)和14.5kD(凝胶过滤法)，最适pH值为5，最适温度是55至60℃；也观察到微晶体纤维素结合。作者推理FAE-II可能是经蛋白水解修饰的FAE-III。最近，根据阿魏酸酯酶的不同底物特异性来辨别来自黑曲霉的各种已知的阿魏酸酯酶并注意到FAE-II和FAE-III不能从甜菜果浆释放阿魏酸(Brezillon等，同上)。

尽管这些鉴定工作已涉及黑曲霉酯酶，但是本领域仍然需要用作各种用途的其它酯酶。此外，本领域技术人员至令未发现用于更有效生产能以适于工业生产的量表达酯酶的遗传工程生物的核苷酸序列。无论如何，迫切需要开发凭借遗传工程的酯酶表达系统以确保酶的纯化和有效量的相对纯的酶的利用。

发明概述

本发明的目的是提供新的酯酶蛋白和编码这种蛋白的DNA。

本发明的目的是提供从许多不同物种分离编码具有酯酶活性的蛋白的DNA的方法。

本发明的另一个目的是提供由用编码酯酶活性的DNA转化的适当宿主细胞产生的酯酶。