[发明专利]可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用生物工程方法构建可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的方法。

背景技术：

低醇啤酒既具有啤酒应有的啤酒风味，又具有多饮不醉的优点，同时也符合当今消费者日益重视身体健康的消费趋势，加上妇女对酒精过敏男士对低醇啤酒的喜爱，低醇啤酒正在走俏。

啤酒乙醇的含量是决定低醇啤酒的关键指标，它直接关系到啤酒的品质。如何解决啤酒中乙醇的含量是生产低醇啤酒的关键。目前，降低啤酒中乙醇含量的办法有很多种，其中最理想的方法之一就是构建低醇啤酒基因工程菌株，通过对工业用酿酒酵母本身进行改造来生产低醇啤酒。

发明内容：

本发明的目的是提供一种通过基因克隆技术，将出发工业用酿酒酵母菌株进行了基因改造的方法，从而构建可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，进行初始处理，通过聚合酶链式反应即PCR扩增获得缺失乙醇脱氢酶(以下简称ΔADH I)酿酒酵母菌株，即将其自身乙醇脱氢酶I基因剔除后，将外源枯草芽孢杆菌的乙醇脱氢酶I，以下简称BADHI基因转入剔除后的酵母体内，使基因酵母菌株的乙醇、双乙酰和乙醛含量改变，酿酒酵母BADH I-ΔADH I保藏在：CCTCC保藏号：M207161。

具体过程包括：

1.枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中ADH I基因的克隆(BADHI)；

2.重组质粒pYC6/CT-BADH I的构建；

3 ΔADH I酿酒酵母菌株的获得；

4 恢复突变酵母BADH I-ΔADH I的获得；

5 HDY-01酵母(酿酒酵母，由黑龙江大学生命科学学院微生物重点实验室保存)、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母酶活力测定；

6 遗传稳定性试验；

7 HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母发酵实验。

这个技术方案有以下有益效果：

通过本发明，成功构建了酿酒酵母的ADH I缺失菌株和恢复突变酵母BADHI-ΔADH I。BADH I-ΔADH I经过连续15天发酵实验证明，其乙醇含量、乙醛含量和双乙酰含量均较出发菌株有所降低。

HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母酶活力测定

ADH I在代谢过程中产生的H⁺可以和NAD⁺(即氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NADH，NADH在OD340nm下有最大吸光值，我们通过测定NADH的吸光值变化情况就可以反映出ADH I酶活力大小。酶活定义为单位湿细胞在单位时间使吸光值每发生0.001的改变定义为一个酶活。

测定结果表明在相同条件下HDY-01酵母ADH I酶活力最强，ΔADH I酵母菌酶活力最弱，而BADH I-ΔADH I酵母菌酶活力位于两者之间。这是由于ΔADH

I酵母菌酶丧失了ADH I基因不能代谢生成乙醇，所以在检测过程中酶活力处于最低，而BADH I-ΔADH I酵母菌由于转入了枯草芽孢杆菌的BADH I基因，此基因与酿酒酵母的YADH I基因相比，酶活力不如YADH I基因，所以BADH I-ΔADHI酵母菌的酶活力在测定过程中要比HDY-01酵母的酶活力低。

遗传稳定性试验

HDY-01酵母在含有100μg/毫升潮霉素的YPD平板上不能生长，也不能在含有50μg/毫升的Blasticidin的YPD平板上生长，而ΔADH I酵母菌在含有100μg/毫升潮霉素的平板上能够生长，因为其中引物了从质粒pCAMBIA克隆的潮霉素抗性基因片段。BADH I-ΔADH I酵母菌能够在含50μg/毫升的Blasticidin的YPD平板上生长，因为其中转入了pYC6/CT质粒，质粒上带有Blasticidin抗性标记。将传代的每一代ΔADH I酵母菌均匀涂布在含100μg/毫升潮霉素的YPD平板上，BADH I-ΔADH I酵母菌每一代涂布在含50μg/毫升的Blasticidin的YPD平板上，抗性传代12代后菌株性能保持稳定。酶活力检测表明，连续传代12代后，酶活力保持稳定。

HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母发酵实验