[发明专利]可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法

权利要求书

1.一种可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，其特征是：进行初始处理，通过聚合酶链式反应即PCR扩增获得缺失乙醇脱氢酶的ΔADH I酿酒酵母菌株，即将其自身乙醇脱氢酶I基因剔除后，将外源枯草芽孢杆菌的乙醇脱氢酶I即BADHI基因转入剔除后的酵母体内，使基因酵母菌株的乙醇、双乙酰和乙醛含量改变，酿酒酵母BADH I-ΔADHI保藏在：CCTCC保藏号：M207161。

2.根据权要求1所述的可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的初始阶段包括：设计引物并进行扩增，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy在16℃连接过夜，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5 α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒SK241提取重组质粒DNA，回收。

3.根据权要求2所述的可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的设计引物为：首先进行枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中ADH I基因的克隆(BADHI)包括：根据Gene Bank基因文库登陆的枯草芽孢杆菌ADH I基因序列(NC 000964)，设计一对特异性引物，每个引物30个碱基，用于扩增ADH I基因，在上游和下游分别加上酶切工具酶Xba I的识别位点(斜线表示)，BADH上游引物5’—AGT TCT AGA ATG CAG AAA TTC CAC ACA TTT G—3’；BADH下游引物5’—G GAA TGC AGA TCT GGA TTT TGC CAT ATT CAC—3’，所述的扩增为：用灭菌牙签挑取少许对数生长时期的枯草芽孢杆菌，放入PCR管中，利用PCR程序中的90℃扩增过程扩增2小时，即可将枯草芽孢杆菌细胞破碎，使全基因组DNA游离出来，作为模板。

4.根据权利要求2或3所述的可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的回收是将PCR产物用上海华舜生物工程有限公司DNA胶回收试剂盒进行回收，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy的16℃连接过夜，连接产物命名为pGMT-BADH I，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌E.coliDH5 α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒(SK241)提取重组质粒DNA，备用。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I过程中为使BADHI基因与表达载体pYC6/CT进行连接，首先通过Xba I单酶切pGMT-BADH I和pYC6/CT，酶切体系如下表：

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I包括的酶切为单酶切产物，容易发生自连，我们将单酶切后的线性pYC6/CT质粒进行去磷酸化处理，防止自连的发生。

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的通过PCR扩增获得ΔADH I酿酒酵母菌株的过程包括：通过PCR扩增两端含有与酵母的乙醇脱氢酶IYADH I同源片段的潮霉素基因片段和PCR产物直接转化酵母菌。