[发明专利]一种检测牛乳中沙门氏菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测牛乳中细菌的方法。

背景技术

沙门氏菌属于人畜共患病原菌，是世界卫生组织(WHO)所列最主要的食源性病原细菌。沙门氏菌不仅能导致动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例居于前列。2003年WHO的一份报告中指出：“虽然在欧洲的一些国家中沙门氏菌的致病率呈下降趋势，但沙门氏菌在所有由食源性致病菌引起的病例中占有75％，这说明了沙门氏菌仍然是引起食物中毒的最常见的食源性致病菌。

沙门氏菌作为致病菌检测的一项重要指标，在食品安全特别是乳品安全检验检疫中是必需检测的项目，有重要的社会、经济的意义。传统的沙门氏菌的检测常用分离培养和血清学方法，分别采用不同的检验程序、方法，分别报告，确诊检验结果至少需5～7天。这些传统的沙门氏菌检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低的缺陷。

LAMP技术的全称是环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification)，是2000年由日本学者Notomi等发明一种新型的基因扩增技术。LAMP技术利用特异性引物(4种)和两个辅助引物，以识别靶基因的六个特定区域。反应在等温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在一小时内完成；扩增产生的产物量大，肉眼、电泳或比浊仪均可判度结果；灵敏度高、特异性强，极适于病原菌检测。

目前针对食源性致病菌的基因检测技术(如PCR技术或LAMP技术)的检测第一步大都采用预增菌来获得足够的菌体，在预增菌步骤后再进行PCR检测，能够达到很低的检测限；但预增菌步骤一般需要8～12h，无形中就增加了一个工作日的检测时间，增加了检测时间及检测成本。如果不预增菌直接进行PCR或LAMP检测食品样品其检测灵敏度均不理想。

随着我国经济的快速增长和乳品行业的蓬勃发展，牛乳已经成为百姓生活中必不可少的营养食品，牛乳的食用安全性也备受重视。但是现在没有一种可以快速检测牛乳中沙门氏菌的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统的沙门氏菌检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低的缺陷及现有的PCR技术或LAMP技术必需预增菌，无法快速检测牛乳的问题，而提供的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法。

检测牛乳中沙门氏菌的方法按以下步骤进行：一、被检测牛乳脱脂；二、按脱脂牛乳与EDTA溶液6～8∶1的体积比向脱脂牛乳中加入质量浓度为40％～60％的EDTA溶液，然后在37±1℃条件下水浴40～50min；三、过滤：无菌操作；四、用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌，然后离心洗脱液，再弃去上清液，并用1mL TE溶液重新悬浮沉淀物，之后再次离心、弃去上清液，用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品DNA；五、LAMP扩增：25μL扩增体系由2.5μL 10×ThermoPol Buffer、1μL浓度为1.4mM的dNTP、1.6μL浓度为25μM的FIP引物、1.6μL浓度为25μM的BIP引物、0.8μL浓度为25μM的F3引物、0.8μL浓度为25μM的B3引物、0.4μL浓度为25μM的Loop f引物、0.4μL浓度为25μM的loop b引物、5μL样品DNA、0.5μL Bst聚合酶和10.4μL灭菌超纯水组成，扩增条件为65℃扩增60min；六、鉴定：取LAMP扩增产物5μL，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶，再以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳45min，然后在凝胶成像系统中成像；其中步骤六使用的琼脂糖凝胶中含有0.25μg/mL的溴化乙啶。

本发明方法简单、省时，检测操作仅需约3小时(对原料乳的初处理至分析鉴定完毕，全部流程可以控制在6.5h以内)，大大的提高了被检牛乳产品的新鲜度和货架期；而且本发明方法不需要预增菌，具有快速灵敏的优点。本发明克服了现有技术无法采用过滤法直接对牛乳中沙门氏菌进行快速富集检测的缺陷。本发明方法利用螯合剂EDTA对二价金属离子具有螯合作用，可以夺取酪蛋白胶束中的Ca²⁺，使酪蛋白胶束解离成小分子酪蛋白单体，从而克服了牛乳酪蛋白胶束在快速过滤富集过程中的阻遏作用，达到过滤直接快速富集检测沙门氏菌。

本发明方法利用沙门氏菌特异性引物，采用优化的LAMP反应系统，成功地以沙门氏菌invA基因为靶基因进行扩增，特异性强，准确率高达99.6％。

附图说明

图1是具体实施方式十一检测结果的凝胶电泳图。

具体实施方式