[发明专利]一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法

权利要求书

1.一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，其特征在于分析方法的步骤如下：一、利用被检测原核生物RNA为模板反转录获得的cDNA进行梯度稀释绘制出倍比稀释标准曲线，获得斜率slope，通过PCR效率公式E＝10^[-1/slope]-1计算出Real-time PCR效率E；二、原核生物的总核酸的提取：利用酚-氯仿法提取处于对数生长中期的被检测原核生物的总核酸；三、对所提取的总核酸制备反转录样品和非反转录样品，制备方法如下：取两等份的经步骤二提取的被检测原核生物总核酸；将其中的一份进行反转录反应得到反转录样品；将另一份用体积浓度为0.1％的DEPC水稀释至与RT样品相同的浓度，获得非反转录样品；四、在步骤三得到的反转录样品和非反转录样品进行Real-time PCR检测，将步骤三中分别获得反转录样品的Ct_RT值和非反转录样品的Ct_RT-值；五、原核生物基因相对定量表达的分析：指定被检测原核生物中一组基因表达量Q′为参照组采用上述步骤测得的数据通过相对定量公式QR=QQ′=(1+E)-ΔCt-1(1+E)-ΔCt′-1]]>计算原核生物基因的相对表达量Q_R；其中Q表示目的基因的表达量，Q′表示参照基因的表达量，ΔCt＝Ct_RT-Ct_RT-，ΔCt′＝Ct_RT′-Ct_RT-′，E＝10^[-1/slope]-1，Ct值是指荧光信号达到阈值时的循环数，RT表示反转录，RT^-表示非反转录。

2.根据权利要求1所述的一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，其特征在于所述的步骤一中的计算斜率slope方法如下：将cDNA分别进行5个10倍梯度稀释，然后进行Real-time PCR检测；设稀释的最低模板浓度为10¹，以模板浓度倍数的对数值lg10¹～lg10⁵为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，得到斜率slope。

3.根据权利要求1所述的利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，其特征在于所述的步骤二中提取总核酸方法如下：先活化基因的菌株，然后将活化后的细菌菌株接种于培养基中，培养到对数生长中期时，将菌液离心分离收集菌体，再利用常规的酚-氯仿法提取总核酸。

4.根据权利要求1所述的一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，其特征在于所述的步骤三中基因的RT样品制备方法如下：取经步骤二方法提取被检测原核生物中总核酸进行反转录反应，反转录的温度为42℃，反转录的时间为15min，反转录酶失活的温度为95℃，反转录酶失活的时间为2min，得到反转录样品。

5.根据权利要求1所述的一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，其特征在于所述的步骤四中对被检测原核生物的反转录样品和非反转录样品进行PCR扩增，PCR反应条件为95℃变性10s后，95℃5s，60℃ 34s扩增40个循环，将在60℃ 34s时收集荧光信号设定为阈值，再分别测定反转录样品的Ct_RT值和非反转录样品的Ct_RT-值。