[发明专利]一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法

说明书

技术领域

本发明属于基础生物学及医学领域，涉及一种原核生物基因表达的相对定量分析方法，具体是指利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法。

背景技术

随着生物基因组学和生物信息学的不断发展以及功能基因组学研究的深入，基因表达研究成为近年的研究重点。原核生物是整个生物界重要的组成部分，与人类的生存活动密切相关，相应研究已从结构基因组学逐步转入功能基因组领域的探索性研究，从而最终实现原核生物系统生物学的建立。目前对原核生物基因表达的研究主要是从基因的转录水平进行分析，也就是从RNA角度进行定性定量的研究。由反转录PCR发展而来的实时荧光定量反转录PCR(Real-time RT PCR)技术，在生物、医学、食品检测等领域均得到广泛应用，成为基因转录水平上对基因表达进行分析的重要方法。

现有利用Real-time RT PCR技术对原核生物基因表达进行相对定量分析的整个操作计算过程中，基于不同的实验考虑，对以下三个关键部分的处理方式往往各不相同，所采取的方法也分别存在一定的不足：

1、用任何方法提取的RNA中都不可避免的会有部分DNA存在。对于真核生物可以通过PCR引物的跨内含子设计或者mRNA纯化，消除RNA检测中的DNA影响。而原核生物的mRNA不含有内含子及polyA结构，一般是利用DNaseI(RNase Free)对其DNA进行处理，即在37℃酶解10-30分钟不等，再经高温对DNase I灭活或通过苯酚-氯仿抽提去除DNase I酶。由于原核生物的RNA本身稳定性较差，上述的处理过程对RNA的总量及质量会造成较大影响。

2、在RNA相对定量分析中，由于菌体/细胞的不同处理方式或操作差异，均会导致用于提取RNA的初始菌体/细胞量不同。若将样品材料统一到相同菌体/细胞量提取是非常困难的，应选择一种在整个处理过程中转录水平稳定的基因作为内标对初始菌体/细胞量进行均一化校正。一般选择16S rRNA等作为原核生物的内标。但2002年，Vandecasteele SJ等人研究表明，16S rRNA的含量并不稳定，在菌体的不同生长时期也会出现较大的波动。

3、基因表达相对定量的具体分析算法。相关的算法有很多种，最初用外标法进行相对定量，即根据一系列已知拷贝数的外标物作标准曲线，确定目的基因和管家基因(House keeping gene)的确切模板量，将两者的比值作为相对定量的最终结果。这种方法需要进行扩增序列的质粒克隆，并通过检测计算确定拷贝数，才能绘制出绝对定量标准曲线。这种以绝对定量为基础的相对定量分析过程繁琐，易产生误差。后来基于PCR扩增的动力学模型，出现(1+E)^-ΔΔct算法：Q_R＝(1+E)^-ΔΔCt，其中Q_R为实验组中的目的基因与对照组中目的基因的相对定量的结果，ΔΔCt＝(Ct_目的基因-Ct_参照基因)_实验组-(Ct_目的基因-Ct_参照基因)_对照组，Ct值是指荧光信号达到阈值时的循环数，E为PCR效率。但以往PCR效率的计算均由已知确切拷贝数的绝对定量标准曲线的斜率计算出来，使整个操作、计算过程更为复杂，不易推广使用。ABI公司在推出ABI 7700型Real-time PCR仪时，所推出的2^-ΔΔCt法(ABI，Sequence Detector User Bulletin 2)：Q_R＝2^-ΔΔCt，这种算法假设相对定量中各PCR反应的效率E均为1，可以用来对基因的转录水平进行大致的相对定量分析，但是当PCR效率不高或多种基因间PCR效率差别较大时，所分析出的结果误差较大，在实际应用中具有一定局限性。

发明内容

本发明提供了一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，目的是为了解决DNA残留，及菌体生长过程中管家基因表达不稳定和当PCR效率不高或多种基因间PCR效率差别较大时，所分析出的结果误差较大，致使现有基因表达相对定量在实际应用中具有一定局限性的问题。