[发明专利]一种编码β－葡萄糖苷酶的基因

说明书

技术领域

本发明涉及从未培养微生物中克隆的酶基因，尤其涉及通过构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库而筛选得到的酶基因。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×10⁹吨，其中89％尚未被人类利用。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素可通过纤维素酶的作用降解为葡萄糖，后者可作为重要的工业原料来生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖的三类酶的总称，即内切β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又称纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。这三种酶协同作用能够将纤维素转化成葡萄糖。内切葡萄糖苷酶能随机地在纤维素分子内部降解1，4-β-糖苷键，将长纤维切成短纤维；外切葡萄糖苷酶能从纤维素分子的还原或非还原端切割糖苷键，生成纤维二糖；β-葡萄糖苷酶最终把纤维二糖解离成单个的葡萄糖分子。β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，存在于自然界许多植物体，还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。它的特性是可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。在纤维素的糖化作用中，β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。根霉能在许多种纤维素质上生长，正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。

β-葡萄糖苷酶的分布较为广泛，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍。对微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要在酵母、细菌、真菌、链霉等。β-葡萄糖苷酶基因现已从燕麦、蜀黍、旱金莲、长春花、黑檀等植物中进行了克隆和表达。但更早对β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达的研究是在微生物体中。Grabnitz F.et al.对芽孢梭菌β-葡萄糖苷酶基因结构的序列分析，表明纤维素酶和包括人体乳糖酶的β-葡萄糖苷酶形成了一个超基因簇。Gonzalez-Candelas L.et al.研究认为，从芽孢杆菌分离出的两个编码β-葡萄糖苷酶基因序列和同源性分析，已知确定了从芽孢杆菌中分离出的编码β-葡萄糖苷酶的两个基因bg1A和bg1B的核苷酸序列。近几年国际上对β-葡萄糖苷酶的研究日趋广泛。2005年，Li X.et al.对来自Volvariella Volvacea(草菇)的一种重组表达后的β-葡萄糖苷酶进行了酶学性质的详细分析。2006年，Di Lauro B.et al.报道了一种来自革兰氏阳性的细菌Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009(嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌ATCC27009)的新型β-葡萄糖苷酶。

现在国际微生物学界广泛认为未培养微生物在自然界土壤栖息群中占99％以上的资源。因此，自从上个世纪90年代末以来未培养微生物就成为了主要研究热点之一。未培养微生物中蕴含着大量的微生物基因资源。近年来对未培养微生物的研究方法已经日趋成熟，其基本原理就是通过直接提取环境宏基因组DNA，构建宏基因组DNA文库，然后采取活性筛选策略或者直接测序筛选策略筛选文库，以获得所需要的目的基因。当前人们已经利用构建宏基因组DNA文库的方法获得了各种活性物质的编码基因，抗生素等。在未培养微生物β-葡萄糖苷酶研究方面，Walter等人构建老鼠大肠未培养微生物的DNA文库，筛选得到了一批β-葡萄糖苷酶基因。但是目前对污染的碱性土壤环境中的微生物研究比较少，至今没有在这样的极端环境中克隆相关β-葡萄糖苷酶基因的报道。

主要参考文献：

1)Dunla P.C.，Chiang G.C.，Utilization and recycle of agriculture wastes and residues[M].Shuler M L，Boca Raton，Florida.USA：CRC Press Inc，1980，191