[发明专利]抗牛朊蛋白PrP27－30的单克隆抗体及其应用

权利要求书

1.抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6，其特征在于其轻链可变区基因为序列表<400>2，其重链可变区基因为序列表<400>3。

2.权利要求1所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6的制备方法，其特征是以牛PrP27-30编码基因为目的产物选择模板与引物，用聚合酶链式反应扩增出牛PrP27-30编码基因，用NdeI和XhoI双酶切扩增产物和原核表达载体，回收酶切产物，再在连接酶的作用下将酶切后的PrP27-30编码基因和原核表达载体连接，将连接产物转入E.Coli JM109感受态细胞中进行培养，然后将培养菌液涂布于含卡那霉素的培养基上培养，并用挑取单菌落方式扩大培养，得到含有牛PrP27-30编码基因的重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌进行诱导表达，纯化表达产物，以经纯化的表达产物为免疫抗原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选并克隆出阳性杂交瘤细胞株，在鼠体内接种杂交瘤细胞，生产腹水抗体，收集腹水进行纯化，得到抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6。

3.根据权利要求2所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6的制备方法，其特征是采用含有牛PrP编码基因ORF的克隆质粒boPrP-T为模板，采用的上游引物F-boPrP102aa-NdeI为：

5-gggaattccatatggtcaaggtggtacccacg-3

采用的下游引物R-boPrP241aa-XhoI为：

5-ccgctcgagtgcccctcgttggtaataag-3’

用NdeI和XhoI双酶切克隆的PrP27-30编码基因和pET-30a(+)表达载体，连接双酶切产物，再将连接产物转入E.Coli JM109感受态细胞中进行培养，然后将培养菌液涂布于含卡那霉素的培养基上培养，并用挑取单菌落方式扩大培养，得到含有牛PrP27-30编码基因的重组质粒p30a-boPrP27-30的E.Coli JM109菌株p30a-boPrP27-30-JM109，从菌株p30a-boPrP27-30-JM109中提出质粒p30a-boPrP27-30再转化至E.Coli BL21(DE3)感受态细胞，再用转化后的菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂粉平板培养，获得含有质粒p30a-boPrP27-30-BL21的E.Coli BL21(DE3)菌株----p30a-boPrP27-30-BL21，再将此菌株接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培养，使重组牛PrP27-30被E.Coli BL21(DE3)在IPTG诱导下进行高效表达，用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达产物，再用切胶后的电洗脱法纯化蛋白，得到重组牛PrP27-30蛋白，以此重组牛PrP27-30蛋白为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，采用间接ELISA方法筛选融合的杂交瘤细胞株，再用有限稀释法克隆筛选的阳性杂交瘤细胞株，获得了能够稳定分泌抗重组牛PrP27-30的阳性杂交瘤细胞株----csPrP102-6，在鼠体内接种杂交瘤细胞csPrP102-6，生产腹水抗体，取出腹水，离心收集上清液，进行纯化得到抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6。

4.权利要求2或3所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6的制备方法中的质粒p30a-boPrP27-30，其基因序列表为<400>1。

5.权利要求1所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6用于制备检测海绵状脑病的诊断试剂。

6.权利要求1所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6用于制备海绵状脑病的免疫治疗制剂。

7.权利要求1所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6的轻链和重链的编码基因用来制备抗牛朊蛋白PrP27-30的单链抗体。

8.权利要求1所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6制备的单链抗体用于制备检测海绵状脑病的诊断试剂。

9.权利要求1所述的抗牛朊蛋白PrP27-30的单克隆抗体mab-PrP102-6制备的单链抗体用于制备海绵状脑病的免疫治疗制剂。