[发明专利]一种磷脂酶D的生产方法

说明书

技术领域

一种磷脂酶D的生产方法，涉及发酵领域。具体的说是采用固态发酵的方法生产磷脂酶D，以小麦、麸皮、豆饼粉和麦糟为固态基质，并添加磷酸二氢钾、七水硫酸镁、葡萄糖等物质，通过固态发酵生产磷脂酶D。

背景技术

磷脂作为一种生物活性物质，有着独特的理化性质和营养价值，在世界范围内的食品、保健品、医药以及饲料行业已被广泛使用。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是磷脂家族中的一员，近20年来国内外的动物试验及临床应用，表明PS对改善记忆和认知能力、防治老年痴呆症、抑郁症及缓解精神压力都有显著疗效。

目前大规模生产磷脂酰丝氨酸的重要性不仅仅在于其生物学及工业化应用潜力，同时也与其在保健、营养品方面的逐渐应用有关。然而无论从自然界分离提取或化学合成法生产磷脂酰丝氨酸都十分复杂，目前研究人员正寻求利用酶特别是磷脂酶D进行酶法转化来定向合成磷脂酰丝氨酸，如专利申请文献1～3。[专利申请文献1：公开号CN155288A；专利申请文献2：公开号CN1897919A；专利申请文献3：公开号CN1468314A]

磷脂酶D(Phospholipase D，PLD；EC 3111414)首先发现于植物中(如卷心菜、花生等作物)，之后在微生物(链霉菌、大肠杆菌、沙门氏菌等)和哺乳动物细胞中均有发现。它不但可以水解卵磷脂生成磷酸脂和胆碱，通过打断其磷酸酯键完成反应，而且当有分子作为亲核供体时，磷脂酶D能催化转酯反应。同时，来自微生物界的磷脂酶D相对于来自植物界的有更强大的转酯能力，底物特异性低。其中又以源自链霉菌属的磷脂酶D的转酯能力尤为突出。

但是，目前采用液体发酵产酶水平低、发酵周期长(一般要接近7天)、生产成本高等缺点给实际应用带来了很多困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种磷脂酶D的生产方法，用固态发酵，具有单位基质酶活高，发酵周期短，生产成本低等特点，为大规模应用提供了便利条件。

本发明的技术方案：一种磷脂酶D的生产方法，以小麦、麸皮、豆饼粉和麦糟为固态基质，并添加磷酸二氢钾、七水硫酸镁和葡萄糖，通过固态发酵生产磷脂酶D；

以肉桂链轮丝菌AS 4.1084为出发菌株；该菌株详见中国科学院典型培养物保藏委员会菌种目录网页http://www.ctcccas.ac.cn/，本申请人亦可向公众提供。

固态基质：以麦糟为基本质量单位，小麦、麸皮、豆饼粉添加比例为：小麦添加麦糟质量的2％～5％，麸皮添加麦糟质量的5％～10％，豆饼粉添加麦糟质量的3％～8％；固态基质按常规加水进行蒸煮备用；

磷酸二氢钾的添加量为固态基质和水总质量的0.1％～0.4％，七水硫酸镁的添加量为固态基质和水总质量的0.03％～0.075％，葡萄糖的添加量为固态基质和水总质量的0.4％～1％；

固态发酵条件：接种量为：菌株的种子培养液与固态培养基总质量的体积质量比为5％～10％，发酵初始水份为56％～68％；发酵初始pH 6.8～7.2，发酵过程品温25～32℃，发酵时间72～120小时。

所述的磷脂酶D的生产方法，麦糟改用麦糟、玉米芯、干玉米秸秆中的任意一种或几种的组合物替代。

所述的磷脂酶D的生产方法，麦糟、玉米芯、干玉米秸秆需粉碎，粉碎的细度为1～3cm。

本发明所述的肉桂链轮丝菌AS 4.1084购自中国科学院典型培养物保藏委员会。

本发明所述方法中其它没有具体描述的部分均采用本技术领域公知的或已公开报道的方法。在本发明所进行的描述中，如无特别说明均为质量百分比。

本发明的有益效果：1)固态发酵是一种传统的发酵方法，由于固态发酵水分少，每克基质的体积小，这将带来一系列的好处：如a、要处理的废水量很少；b、产品浓缩在基质里，往往不要过滤浓缩就可以使用；c、即使要萃取制成酶制剂，所需的溶剂量较少；d、成品储藏所需的场地较少；

2)同液体发酵相比具有单位基质酶活水平高，发酵周期短，生产成本低等特点，为实际大规模应用提供了便利条件。

具体实施方案

实施例1磷脂酶D酶活测定

步骤一：随机均匀的取10g固体发酵物，加入50mL纯净水，振荡摇匀，在20℃条件下浸泡1h，离心分离得到含磷脂酶D的浸出液。同时，另外再随机均匀的取10g固体发酵物，测定其中的绝干物质含量。