[发明专利]基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种实现原位清除延伸标记物，同时保护引物延伸末端完整、能够逐步合成鉴定未知碱基以及涉及一种“标记延伸-切割-保护延伸”的DNA测序方法。

背景技术

现有技术：在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于最为广泛应用的测序技术是Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法，Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。1990年～1998年，人类基因组序列已完成和正在测序的共计约330Mb，占人基因组的11％左右；已识别出人类疾病相关的基因200个左右。此外，细菌、古细菌、支原体和酵母等17种生物的全基因组的测序已经完成。Sanger法的优势在于可以分析未知的DNA序列，而且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上，然后，在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证或是对为数不多的位点进行分析验证，在这种情况下，较短序列的高通量测序方法更为适用。

测序技术可以在多个领域进行应用，在分子诊断学方面，可以用于病原微生物的快速鉴定，遗传病分子诊断(如SNPs，SNP等位频率)，在法医鉴定方面，如对线粒体D-Loop区的HVI和HVII高可变区进行分析，在药物基因组学方面，如瑞典Eurona Medical AB与Pyrosequencing公司合作对血管紧张转换酶(ACE)的SNP进行分析以及在农业生物方面都有诸多应用。

针对基因组测序，目前发展了多种方法，从最先开始的基于Sanger测序法的凝胶电泳测定技术包括后来改进的毛细管电泳测序技术，到非凝胶电泳测序技术的DNA杂交测序(SBH，sequencing by hybridization)和飞行时间质谱技术(time-of-flight mass spectrometry)，再到先在的Solexa公司的大规模芯片测序技术和焦磷酸测序技术以及其他一些单分子测序技术，2006年3月，Solexa公司的总裁就提出了基因组测序重新回温的见解，之后果然不仅有不断的技术(及其相关文章)问世，而且罗氏也在454公司的强力支持下推出了GS20焦磷酸测序系统，在2003年人类基因组测序完成的时候，美国NIH下属的国立人类基因组研究院(NHGRI)已经表示将举国进行革命性的DNA测序技术的开发，并且随之推出了1000美元基因组计划，可见测序技术已经越来越受到关注，无不预示着测序技术在不久的将来，不仅仅是只作为一种科学研究的工具，而且将向一个产业发展，将更好的为人类健康服务，更贴近人类的生活。

发明内容

技术问题：本发明针对上述技术问题，提供基于碱基修饰保护往复延伸的DNA测序方法，该方法能实现原位清除延伸标记物，同时保护引物延伸末端完整、能够逐步合成鉴定未知碱基。