[发明专利]重组人VIP－Humanin融合蛋白制备方法

说明书

技术领域  本发明涉及到生物技术、生物药物领域，尤其是应用DNA重组技术，构建人血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)与Humanin(HN)融合蛋白，通过基因工程大肠杆菌发酵制备重组人VIP-Humanin融合蛋白的方法。

背景技术 人血管活性肠肽(VIP)是一种神经肽，全长为28个氨基酸，C端是酰胺化天冬酰胺。VIP主要是神经内分泌及旁分泌作用，包括促进周围血管扩张，平滑肌扩张，抑制胃酸分泌，增进乙酰胆碱(ACh)作用，促进脂肪和肝糖原分解，促进胰岛素分泌，促进小肠的电解质分泌等；在中枢神经系统，VIP促进催乳素分泌，对大脑皮质神经元有兴奋作用，对脊椎运动神经元亦有除极作用。VIP还参与睡眠生理的调节，可促进睡眠的作用。另外，VIP会促进淋巴腺B细胞产生抗体，抑制T细胞增殖，调节天然杀伤细胞的杀伤活性等。

人Humanin(HN)是Hashimoto等于2001年发现的一种神经保护性多肽，全长为24个氨基酸。它能够特异且有效地阻断由家族性阿尔茨海默(FAD)基因和β淀粉样肽(Aβ)引起的神经细胞死亡。其作用机制可能是HN通过特异性地阻断某些细胞死亡的信号通路达到保护神经细胞的作用。2001年Mamiya T.，等用化学合成的[Gly(14)]-HN进行细胞和小鼠实验，结果表明后者比HN更有效，对小鼠的学习和记忆能起到非常明显的改善作用。因此HN是一种非常有前景的抗AD药物。

鉴于上述二种多肽的药用效果及自身结构特征，本发明将它们设计为一条融合肽，以期达到药物生物利用度高、药效更好的目标。

发明内容

1.根据人VIP和HN的初级结构，设计了一个串联共表达融合蛋白。VIP位其N端，HN位其C端，中间为自行设计的连接小肽，长度为13个氨基酸，两头是双碱性氨基酸。顾及融合蛋白的成熟所需，在VIP前加上肠激酶识别序列(-DDDDK-)。

2.基于1，采用大肠杆菌偏爱密码，获得编码该融合蛋白的DNA序列；两侧加上BamH I和SacI的识别序列及保护性碱基。依此设计并合成了6条PCR所需的引物，采用搭桥法经PCR获得所需的DNA片段，测序后由BamH I和SacI位点定向克隆进pET28a(+)，得到表达载体。

3.阳性克隆发酵条件经优化，获得高表达目的产物。

4.采用多种层析等分离纯化方法，获得VIP-HN融合蛋白。

附图说明

图1.构建表达载体示意图

图2.采用搭桥法合成目的基因的图解

图3.经过搭桥法PCR获得目的DNA在1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱.其中第一道为100bp landerMarker，第二道为PCR产物，目的基因为231bp，由图可见在200bp和300bp之间有一条带。

图4.融合蛋白VIP-HN编码基因的测序结果(图中箭头标出51位到263位为目的基因序列)

图5.融合蛋白VIP-HN诱导表达结果的Tricine-SDS-PAGE图谱，1、诱导发酵4h；2、诱导前发酵4h.3、分子量标记物(自上而下，分别为97、66、45、30、20.1、14.4KD)由图可见，诱导前后有明显变化，在11KD左右有明显的表达蛋白，与目的蛋白相近。

图6.融合蛋白VIP-HN的基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱(MADIL-TOF/MS)图谱

具体实施方式

1.rhVIP-HN基因的克隆

1.1串联共表达融合肽的设计

VIP和HN都是对阿尔茨海默病有改善作用的线性多肽，其中VIP有28个氨基酸，HN有24个氨基酸，它们单独表达都较困难，VIP的C端无法酰胺化，并且若分别表达两个分子量很小的多肽对后期的分离纯化也造成很大不便。所以考虑将VIP和HN串联共表达不但提高了分子量，还解决了VIP的C端酰胺化的问题，而且期望其在对抗阿尔茨海默症的功效上能有协同作用。在VIP和HN之间设计13个氨基酸的连接肽，防止两个多肽间结构的相互影响。在N端加入肠激酶的酶切位点以去除载体上的融合表达肽段。

重组VIP-HN融合肽的氨基酸序列：

1.2 rhVIP-HN基因引物的设计

根据VIP和HN的氨基酸序列按大肠杆菌偏爱密码子转换成基因序列，采用搭桥法获得目的基因需合成六条引物，在5’端和3’端的两条引物分别加上BamH I和Sac I两个限制性酶切位点。引物合成量均为2OD，稀释至终浓度为50pmol/μL。

1.3rh VIP-HN基因的合成

采用搭桥法进行目的基因的合成，PCR扩增目的基因