[发明专利]一种新的促红细胞生成素类似物

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种具有至少一个 额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物或其变体。本发明还涉及编 码所述促红细胞生成素类似物或其变体的DNA序列，以及表达该类似 物或其变体的重组质粒和宿主细胞。

发明背景

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是第一个被发现并应用于临 床的造血生长因子。早在1906年，Carnot等发现兔失血后会在外周血 中产生一种可作用于造血系统以加速红细胞生成的物质，由此提出存 在一种体液因子以反馈方式调节血细胞生成。时隔30多年以后此观点 才得以证实，这种因子被命名为促红细胞生成素。促红细胞生成素又 称血细胞生成素、红细胞刺激因子，属酸性糖蛋白，是调节前体红细 胞增殖、分化以及保持外周血中红细胞浓度处于正常生理范围内的最 主要激素。它可与红细胞前体细胞表面的EPO受体结合，促进其血红 蛋白的合成使之增殖分化成红细胞，从而调节体内红细胞和血红蛋白 的生理平衡。EPO是一个强有力的造血生长因子，体外分析显示在 0.05～1U/ml的浓度时即具有剂量依赖效应。EPO可刺激红系祖细胞 (BFU-E)和早幼稚红细胞(CFU-E)形成成熟的红细胞集落。EPO除了作 用于骨髓巨核前体细胞外，对其他造血细胞均无作用，是迄今认为作 用最单一的造血生长因子。当然，对红细胞造血过程的完整调节，除 了EPO外，还需要其他因子的协同作用，包括Multi-CSF、GM-CSF 和IL-1，这些因子促使干细胞变成BFU-E，并联合刺激使红细胞早期 增殖，随后才是EPO的增殖作用。

1977年，Miyake等从重症再障贫血病人的尿中提取得到了EPO 的纯品，由于起始来源的匮乏，很难得到大量纯品以充分研究其生物 学和分子学性质。1984年，科学家们首次以人肾癌细胞的EPO mRNA 为模板，经逆转录合成cDNA并在大肠杆菌中得以克隆并表达，在此 基础上获得了EPO的完整基因并在真核细胞中进行高效表达，为深入 研究EPO的生物学效应并将之应用于临床奠定了基础。现在国内外已 能用基因工程方法生产重组人红细胞生成素(rhEPO)，并用于临床治疗 多种红细胞减少症，具有很好的疗效。

真核细胞产生的许多细胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一个或更多 寡糖基团修饰。这种称为糖基化的修饰能强烈影响蛋白质的理化性质， 对蛋白质的稳定性、分泌和亚细胞定位也会起重要作用。正确的糖基 化有时是生物活性所必需的。某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基 化的细胞过程的细菌(如大肠杆菌)中表达，所回收到的蛋白由于缺乏糖 基化而没有或几乎没有活性。

糖基化作用出现在多肽骨架的特异位置，通常有两类：O连接糖 基化和N连接糖基化。O连接的寡糖连在丝氨酸或苏氨酸残基上，而 N连接的寡糖则连接在作为序列Asn-X-Ser/Thr一部分的天冬酰胺残基 上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。N连接和O连接的寡 糖结构及每种类型中存在的糖残基都是不同的。共同存在于两种类型 中的一类糖是N-乙酰基神经氨酸(以下简称唾液酸)。唾液酸通常是N 连接和O连接寡糖的末端残基，由于它带负电荷，可能会使糖蛋白具 有酸性。