[发明专利]一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用。

背景技术

精子从精原细胞到精子的剧烈形变、雌性生殖道的酸性环境以及顶体反应时质膜和顶体外膜的破裂等变化都容易导致父系基因组DNA的丢失；在这过程中，顶体后部质膜蛋白在维持精子头部形态的完整中起到了重要的作用，并且构成稳固的顶体后部质膜与顶体内膜，共同保证了遗传物质的完整。

获能精子质膜蛋白在受精过程中有与卵母细胞透明带识别和结合的作用。在这一过程中，由于侧重对于透明带结合蛋白的研究，目前较为清楚的多功能性膜蛋白主要位于顶体区质膜，即透明带与精子最先识别的部位。对于顶体后部和精子尾部质膜蛋白而言，这方面的研究甚少，人们只是发现顶体后部质膜蛋白也影响体外和体内受精过程，与卵母细胞膜的融合相关，即顶体后部膜蛋白参与精卵融合过程。多数学者还认为：精子顶体后部质膜和精子尾部质膜蛋白与胚胎的早期发育也有关。顶体后部和精子尾部质膜蛋白也具有防止精子凝集的功能，如大鼠的SMA-4糖蛋白可防止尾与尾的凝聚。另外，顶体后部的蛋白通道可能与外源基因进入精子细胞有关。

精子质膜的肽类分子有数百种之多，蛋白质的纯化有一定的困难，相关的研究工作多处于探索阶段。精子表面的sp18族膜蛋白具有一定的生理功能，它无法独立用一种非离子型去污剂(NP-40或Triton X-100)提取得到，而必须依靠强去污剂SDS(0.1％)的协同才行，即使如此，仍有不溶性的sp18依然存在于膜上。

发明内容

本发明的目的是提供一种哺乳类精子头后部膜蛋白的分离方法及其应用。

本发明所提供的哺乳类(包括人)精子头后部膜蛋白的分离方法，包括下述步骤：

1)制备顶体反应后精子头；

2)将步骤1)制备的顶体反应后的精子头在由pH为7.2-7.6、浓度为10-20mM的Tris·Cl和100μg/ml PMSF组成的低渗液中冰浴，然后离心回收得到低渗精子头；

3)将步骤2)回收的低渗精子头在三去污裂解液中冰浴，然后离心回收上清液即得到哺乳动物精子头后部膜蛋白；所述三去污裂解液含有pH为8.0、浓度为50mM的Tris·Cl，150mM NaCl，0.1g/100ml SDS，体积百分含量为1％NP-40，0.5g/100ml去氧胆酸钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin和0.02g/100ml NaN₃。

所述方法中，所述步骤1)中精子头的制备方法为：以牛精子的处理为例，可按照如下方法制备顶体反应后精子头：用添加10mM咖啡碱的BO溶液或者TALP溶液悬浮精子至10⁶个/ml，加入2-10μM钙离子载体A₂₃₁₈₇或者1-2μM的5-Br-A₂₃₁₈₇(Sigma B₇₂₇₂)，在38.5-39℃，5％CO₂条件孵育0.5-2小时进行充分的顶体反应，然后在1,000rpm(800g)以上转速离心，回收顶体反应后的精子；将顶体反应后的精子在冰水浴条件下超声波处理1-10分钟，在1,500-2,000rpm(1000-1500g)条件下离心洗涤多次，得到的沉淀即为精子头。

所述方法中，所述精子为哺乳类(包括人)精子，优选为牛精子；当所述精子为牛精子时，所述哺乳类精子头后部膜蛋白为牛精子头后部膜蛋白。

由上述处理精子头后部膜蛋白生产的多克隆抗体或单克隆抗体均属于本发明的保护范围。

所述单克隆抗体优选为杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906分泌的单克隆抗体。

实验证明针对精子头后部sp18膜蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体不仅影响精子活力，而且抑制受精过程，参与胚胎的早期发育过程，可以作为一种精子疫苗的候选蛋白，应用到避孕技术中。

本发明还提供了一种精子疫苗。其活性成分是精子头后部的sp18抗原，即上述制备的哺乳类精子头后部膜蛋白。

本发明还提供了一株分泌上述哺乳类精子头后部膜蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为杂交瘤细胞系sp18 mAb CGMCC No.0906。所述杂交瘤细胞系sp18mAb CGMCC No.0906已于2003年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。