[发明专利]提高人凝血酶原复合物稳定性FVII得率的工艺方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，特别是冻干人凝血酶原复合物的生产工艺方法。 

背景技术

现有的人凝血酶原复合物的制造方法包括以下工序：新鲜低温冰冻健康人的血浆→去除冷沉淀→澄清过滤→凝胶吸附→洗涤、洗脱→超滤→S/D病毒灭活→凝胶吸附→洗涤、洗脱→超滤→除菌过滤、分装→冻干→干热灭活。 

该工艺在制造阶段经过S/D和干热两步病毒灭活，病毒灭活比较彻底，各项指标均符合《中华人民共和国药典》标准。但采用此工艺生产制造出的人凝血酶原复合物VII因子、II因子、X因子、IX因子收率较低。 

发明内容

本发明提供了一种提高VII因子、II因子、X因子、IX因子收率的冻干人凝血酶原复合物的生产工艺。能有效提高FVII的吸附率，达到FIX的100％以上。 

本发明所述的冻干人凝血酶原复合物的生产工艺，包括 

(1)低温冰冻人血浆，酒精消毒血浆袋表面后，注射用水化浆，混浆温度0-5℃； 

(2)离心去除冷沉淀，澄清过滤； 

(3)调整离子强度； 

(4)凝胶吸附； 

(5)洗涤、洗脱，收集洗脱液，加入稳定剂； 

(6)超滤浓缩、脱盐； 

(7)S/D病毒灭活； 

(8)调整离子强度； 

(9)凝胶吸附； 

(10)洗涤、洗脱，收集洗脱液，加入稳定剂； 

(11)超滤浓缩、脱盐； 

(12)配制、无菌分装、冻干； 

(13)干热灭活病毒。 

本发明在两次凝胶吸附前分别调整其离子强度使电导控制在2-12ms/cm，增加凝血因子与凝胶的结合力，从而提高VII因子、II因子、X因子、IX因子的收率。尤其能有效提高FVII的吸附率，达到FIX的100％以上。 

洗涤、洗脱和超滤冲洗液配方除了氯化钠，增加稳定剂枸橼酸钠，在整个洗涤洗脱过程中均匀加入，其中枸橼酸根离子能与血浆中的钙离子络合形成一种难解离的可溶性络合物-枸橼酸钙，使血中钙离子减少，凝血过程受到抑制，进而抑制凝血因子的激活，减少了活化的凝血因子的产生。枸橼酸钠在洗涤洗脱液中的终浓度为10-25mmol/L。 

本方案的有益效果可根据对上述方案的叙述得知，由于在两次凝胶吸附前都调节了离子强度，在洗涤液、洗脱液增加了稳定剂，提高了因子的收率，尤其是VII因子的收率提高显著，其中FVII的吸附率，达到FIX的100％以上。 

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。 

实施例1 

冻干人凝血酶原复合物的制造工艺包括以下步骤： 

(1)-30℃冰冻人血浆400kg，酒精消毒血浆袋表面后，注射用水化浆，混浆温度0-5℃； 

(2)离心去除冷沉淀，上清澄清过滤得液体体积395L； 

(3)调整其离子强度：10-50转/分钟低速搅拌上清液，以不高于5L/分钟的流速向其中加入10-25℃注射用水，调整其离子强度，使电导控制在2-12ms/cm； 

(4)凝胶吸附：加入溶胀完毕的DEAE-Sephadex A-50湿胶12kg吸附45-60分钟； 

(5)分别用浓度0.15-0.25mol/L的氯化钠40-60L、浓度0.01-0.02mol/L的枸橼酸钠40-60L洗涤凝胶2-5个体积，收集洗脱液； 

(6)超滤浓缩、脱盐； 

(7)S/D病毒灭活：按1∶9加入S/D母液，在25±2℃条件下缓慢搅拌灭活6小时； 

(8)调整其离子强度：10-50转/分钟低速搅拌灭活后液体，以不高于5L/分钟的流速向其中加入10-25℃注射用水，调整其离子强度，使电导控制在2-12ms/cm； 

(9)凝胶吸附：加入溶胀完毕的DEAE-Sephadex A-50湿胶4-8kg吸附45-60分钟； 

(10)分别用浓度0.5-1.5mol/L的氯化钠60-80L、浓度0.01-0.02mol/L的枸橼酸钠60-80L洗脱凝胶2-8个体积，收集得到洗脱液20-50L； 

(11)超滤浓缩、脱盐，得体积6000ml，其IX因子效价为25IU/ml，VII因子效价为29IU/ml，IX因子比活性大于0.7IU/mg蛋白； 

(12)配制、无菌分装、冻干； 

(13)干热灭活病毒。 

调整离子强度后，各因子收率对比如下： 

从上表可以发现，本发明所述工艺提高了因子的收率，尤其是VII因子的收率提高显著，其中FVII的吸附率，达到FIX的100％以上。