[发明专利]一种冠心病和中风风险诊断试剂盒及其制作方法

权利要求书

1.一种冠心病和中风风险诊断试剂盒，其特征是包含有以下主要试剂和辅助用品：

1.1 试剂

1.1.1 包被缓冲液：0.05M(pH9.6)碳酸盐缓冲液

1.1.2 洗涤缓冲液：0.15M(pH7.4)PBS

1.1.3 分析缓冲液：(NH₄)₂SO₄，吐温-20的BSA

1.1.4 终止液：2MH₂SO₄

1.1.5 底物缓冲液：pH5.0磷酸缓冲液

1.1.6 TMB试剂：(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)，微酸性缓冲液

1.1.7 蛋白标准品：浓度为1000ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，50ng/ml，0ng/ml

1.1.8 捕获抗体和酶标检测抗体

1.1.9 正常人血清和阳性对照血清

1.2 辅助品：

1.2.1 96孔酶标板

1.2.2 ELISA检测仪(450nm)

1.2.3 96孔板回旋震荡器

1.2.4 微量加样器

1.2.5 一次性无菌吸头

1.2.6 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管、量筒等

1.2.7 4℃冰箱，37℃孵育箱。

2.如权利要求1所述的冠心病和中风风险诊断试剂盒的制作方法，其特征是包括以下步骤：

1.1 纯化标准蛋白的制备：

1.1.1 经RT-PCR方法克隆人Lp-PLA₂cDNA于真核表达载体，测定cDNA序列；

1.1.2 将测定的cDNA序列克隆到InsetDirect载体系统，此重组载体转染于sf9昆虫细胞，在昆虫细胞中高效表达Lp-PLA2重组蛋白，经亲和层析、离子交换层析、分子筛层析而高度纯化，纯度高达98％以上，作为标准蛋白；

1.1.3 高度纯化的重组蛋白经由MS-SPEC鉴定；

1.2 单克隆抗体的制备：

1.2.1 利用生物信息软件计算机算法，选择具有不同抗原决定簇的高抗原特异性肽段；

1.2.2 经第一步精选后的序列，再由BLAST程序与基因库中的序列相比，而最终选择出2-3个具有高免疫原性且独特的氨基酸序列的肽段，人工合成肽段并纯化；

1.2.3 将此肽段交链于KLH；

1.2.4 免疫小鼠；

1.2.5 由纯化的标准蛋白(Lp-PLA₂)筛选有免疫反应的小鼠；

1.2.6 分离阳性小鼠脾细胞，并与肿瘤细胞融合而产生杂交瘤细胞；

1.2.7 经由进一步的筛选而产生单抗细胞株；

1.2.8 单抗细胞株经培养扩增，分泌单克隆抗体，抗体经由亲和层析而进一步纯化；

1.3 免疫试剂盒的建立：

(1)确定捕获抗体和检测抗体；

(2)辣根过氧化物酶标记检测抗体；

(3)确定捕获抗体和检测抗体的最佳用量；

(4)建立ELISA测试方法。

3.如权利要求2所述的冠心病和中风风险诊断试剂盒的制作方法，其特征是：单抗细胞株经培养扩增，分泌单克隆抗体A和B，A抗体作为捕获抗体，B抗体经辣根过氧化物酶标记而作为检测抗体。

4.如权利要求2所述的冠心病和中风风险诊断试剂盒的制作方法，其特征是：建立和优化ELISA检测方法，包括对试剂的组成成分的确定，捕获和检测抗体用量的确定，及对特异性和灵敏度的测试，组间和组内误差的测试，样品回收率的确定。