[发明专利]系统置换多聚酶链反应

说明书

技术领域

本发明涉及多聚酶链反应PCR基因扩增技术的进一步发展，分子检测应用的一种新PCR途经，尤其是将基因检测PCR系统置换成数十套独立的DNA指示PCR系统轮换使用。

背景技术

在1983年的一个晚上，K.B.Mullis不经意间创造了PCR的奇思妙想(The unusual originof the polymerase chain reaction，Sci，Am.262：56，1990 and US patent#4683202)，并经PE-Cetus公司许多改进而实用。随着从嗜热水细菌来源的热稳定DNA聚合酶的应用(Saiki R.K.，et.al，Science 239：487-491，1988)，PCR技术逐渐成熟、高效、自动化。广泛应用于基因克隆、测序、分子检测等众多领域，奠定了现代分子生物学的坚实基础。并逐渐衍生了众多PCR应用技术及改良操作(Molecular Cloning，3^rd Edit)。

随着人类等各种基因组测序的完成，并进入功能蛋白组时代，分子PCR检测应用越来越广泛，已渗透到生物学的每一个领域。尤其自1989年开始运用于临床检验以来，PCR以其简便、快速、灵敏的优势成为临床实验诊断学的技术热点，已应用于肝炎、肺部感染和性病等传染性疾病及遗传病、肿瘤、优生优育等领域。然而PCR的基因指数式扩增方式太过于灵敏，模板2的20次幂就大约扩增一百万倍。临床应用亟待解决扩增基因产物再污染的假阳性问题。目前一般通过单独的PCR实验室，紫外照射的超净工作台，使用一次性手套和一次性过滤Tip头来控制；进一步也可通过加尿嘧啶N-糖基化酶切割用dU代替dT的PCR产物中的尿嘧啶糖苷键来降解PCR产物防止再污染(Hartley J.L.et.al，1993 PCR Methods App1.3：s10-s14)，但只能切割降解大部分PCR产物；这些措施对高灵敏度PCR而言难以完全有效。

发明内容

为了克服PCR检测易污染，假阳性高的不足。本发明提供一种系统置换多聚酶链反应(System Substitute Polymerase Chain Reaction，ssPCR)，通过置换PCR工作系统规避PCR扩增产物的再污染。

系统置换多聚酶链反应，其特征在于通过部分互补序列的杂交，将待测PCR的扩增转换成包括一套以上的指示PCR系统扩增，所述每套指示PCR系统扩增的是无关的指示模板与待测模板中不同区域保留序列所形成的杂交互补序列，所述指示模板的基因序列是与待测模板无关的基因序列(6-8base碱基以上连续相同为相关.反之无关)。

所述待测模板为双链DNA、单链RNA或DNA-RNA杂交双链，所述单链RNA包括mRNA，所述待测模板保留序列长度为20-200bp。

所述待测模板保留序列长度优选为30-50bp。

所述指示模板为双链DNA，序列长度为80-1000bp。

所述指示模板序列长度优选为80-150bp。

该反应还包括荧光分子信标，所述荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与指示模板序列杂交。

本发明根据现有的PCR系统，设计了一种新的多聚酶链反应途径即系统置换多聚酶链反应(ssPCR)(见图1)，该系统中包括有数十套指示PCR系统，以指示PCR系统来替换待测的PCR系统工作。系统置换多聚酶链反应的原理及操作如下：

以待测标本的基因为待测模板；选取一段无关的基因序列(约80-150bp)作为指示模板1，另一段无关序列为指示模板2，……以此类推指示模板3，指示模板4，……等等。待测模板除留一小段序列(30-50bp)作为杂交保留序列外绝大部分序列置换成指示模板序列。PCR扩增的只是指示模板全序列和待测模板保留的30-50bp的杂交序列。每套指示PCR系统选取待测模板不同区域作为保留序列，即每套指示PCR选取的保留序列是互不相同的。所以每套指示PCR系统的基因序列是完全各不相同、相互独立的。