[发明专利]用动态散斑照明实现准共焦荧光显微的方法及装置

说明书

技术领域

本发明是一种利用动态散斑照明近似实现共焦荧光显微(也就是准共焦荧光显微)的新方法和新装置。该方法能够以非侵入的方式，获取生物组织样品的高时间和空间分辨三维层析显微图像信息，装置结构简单、性价比高、后期数据处理方便、易于操作和推广，有巨大的应用前景和市场，对于临床疾病诊断和生命科学研究等都具有非常重要的意义。

背景技术

在生命科学研究和临床诊断领域，激光扫描共焦显微[1]已经成为一种能够有效获得生物组织样品高空间分辨三维层析图像信息的显微技术。与传统的光学显微技术相比，激光扫描共焦显微具有深层分辨能力和三维层析能力，并且能够有效降低样品的散射光对所获得图像对比度的影响，改善了图像分辨率和成像质量[2]。传统的激光扫描共焦显微镜一般采用复杂的扫描成像方式来获得整个样品的图像，因此图像的获取时间长，同时导致系统复杂，不便于操作；另外，这种系统的价格昂贵，只有为数不多的一些科研单位和医院有条件装备。为了克服传统激光扫描共焦显微镜的缺点，早期的解决方法是采用随机扫描的方式来提高图像信息的获取时间[3]。但是，在共焦显微镜中所采用的共焦针孔在有效避免信号串扰和消除背景影响的同时也大大降低了有效信号的功率。为此，提出了很多新颖的光学显微成像方法，例如，结构光照明显微成像技术[4]。这种显微成像技术具有与传统共焦显微成像技术相近的层析成像能力，但是不适用于对具有一定厚度的样品成像。近年来，出现了一种使用散斑照明的准共焦显微成像技术[5]，这种显微成像技术使用随机变化的散斑图案照明样品，记录一系列宽场荧光图像和相应的散斑照明图案，通过对所获得的散斑荧光图像的统计积分来获得样品的宽场荧光显微图像。随着对“散斑现象”的深入研究，以“散斑摄影术”和“散斑干涉计量术”为基础的散斑计量学逐步发展成为的一门崭新的、具有广阔应用前景的学科[6-8]。目前，使用散斑效应对样品进行宽场照明以获得待测生物样品的三维层析图像已成为一种引起广泛关注的非扫描式三维荧光显微成像技术。

当使用激光光束投射到一光学粗糙表面(即表面平均起伏大于光波波长量级)上时，即呈现出利用普通光照明见不到的斑点状图样，其中的每一个斑点称为散斑(Speckle)，整个图样称为散斑图案(Speckle Pattern)[9]，这种散斑现象是使用高相干光时所固有的。散斑的物理成因可以简单地说明如下：当激光照射到物体表面，其上的每一个物点(面元)都可视为子波源，产生散射光。由于激光具有高相干性的特点，物体表面的每一个物点散射的光将和其他物点所产生的散射光发生干涉。又因为物体表面各个面元是随机分布的(这种随机性由表面粗糙度引起)，则由它们散射的各个子波的振幅和相位都不相同，而且也是随机分布的。所以由各面元散射的子波相干叠加的结果，形成的反射光场具有随机的空间光强分布。当把探测器或眼睛置于光场中时，将记录或观察到一种杂乱无章的干涉图样，呈现颗粒状结构，此即“散斑”。

根据观察方式的不同，散斑可以分为“自由空间散斑”和“像面散斑”两种类型。[10]当激光照明漫射体(反射或透射体)时，在其附近的自由空间产生的散斑称为“自由空间散斑”(或菲涅耳型散斑、“客观”散斑)。观察屏上任一点的光场，来自于整个漫射表面上所有散射点源产生的子波的叠加。散斑的平均尺寸与产生散斑的辐射面对观察点的张角α有关。距离漫射体为z处的散斑的横向平均尺寸为

δx≈λzL=λα,---(1)]]>

式中，λ是光的波长，L为漫射体上照明光束的孔径的线宽度。散斑的纵向平均尺寸为