[发明专利]内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置及其培养方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物的实验室培养技术，涉及一种内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置及其培养方法。具体说，涉及提高微生物可培养性的新型的微生物培养装置的设计以及利用固体或半固体培养基对环境微生物进行培养、分离纯化以及观察的技术。

背景技术

长期以来，人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调查研究和开发利用。但是，研究表明自然界中绝大多数微生物尚不能被目前的纯培养技术所培养。主要原因是培养微生物的培养介质与微生物实际所在环境的介质差别很大，导致微生物在实验室中无法生长繁殖。具体表现为：

(1)采用偏离实际环境的高浓度营养培养基；

(2)培养基中缺乏微生物生长繁殖所必须的微量化学物质；

(3)忽视环境中各种微生物的相互影响，这包括微生物种间的偏利共生关系(Commersalism)和互惠共生关系(Mutualism)以及群落之间的群体感应(Quorum sensing)。

基于对以上微生物不可培养原因的认识，人们开始尝试多种方法试图培养原本不可培养的微生物。

有些学者在保留常规培养方法所使用的传统培养皿的基础上，改进了部分培养措施使得更多的微生物得到培养。例如，在培养基中加入过氧化氢降解物质或抗氧化剂以减少微生物代谢产生的毒性氧；加入微生物相互作用的信号分子以模拟微生物间的相互作用；以及供应新型的电子供体和受体等。尽管以上种种方法能够适当增加微生物的可培养性，但是这些添加物质的选定往往无法准确地反映自然环境中的全部情况，不能很好地解决常规培养方法的主要缺陷一难以模拟自然环境的真实状态，结果费时费力且改进效果不显著。

另一些学者完全摒弃常规培养装置和方法，改用新型的培养装置并开发新型的培养技术，试图从根本上解决常规培养方法的局限性，结果获得了较为显著的效果。

Button(1993)从概率论的角度提出一个崭新的方法-稀释培养法(Dilutionculture)，认为当把海水中微生物群体稀释至痕量时，在海水中主要存在的寡营养微生物可以不受少数几种优势微生物的竞争作用，因而主体寡营养微生物被培养的可能性会大大提高。随后，Schut(1993)等的实际操作验证了该理论的正确性。Connon(1992)在稀释培养法的基础上提出高通量培养法(High-throughputculturing)。将样品稀释至痕量后，采用小体积48孔细胞培养板分离培养微生物。该方法不仅提高微生物的可培养性，还可在短期内监测大量的培养物，大大提高了工作效率。但是，稀释培养法和高通量培养法没有考虑模拟原有的环境条件，也没有考虑微生物之间的相互关联，致使当微生物极度稀释、初始接种量很小时，一些微生物与其他关联微生物之间的联系被削略，很多微生物仍然不可培养。

此外，Zengler等(2002)将海水和土壤样品中的微生物先进行类似稀释培养法的稀释过程，然后乳化，部分微生物形成了仅含单个细胞的胶状微滴。然后将胶状微滴装入层析柱内，使培养液连续通过层析柱进行流态培养。层析柱进口端用0.1μm滤膜封住，防止细菌的进入而污染层析柱；出口端用8μm滤膜封住，允许培养产生的细胞随培养液流出。该方法的特点是让微生物在开放式培养液中生长，使培养环境接近于微生物的自然生长环境，能够很好地提高微生物可培养性，但是成本较高，不利于普及使用。

值得关注的是，一个首创性的微生物培养装置发表于2002年的Science期刊上，由Kaeberlein等设计用于培养潮间带底泥中的微生物，起名为扩散盒(Diffusion growth chamber)。扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0.1um滤膜组成，滤膜只能允许培养环境中的化学物质通过而不能让细胞通过。将底泥样品置于盒内的半固体培养基中，扩散盒放在置于鱼缸底部的天然海洋底泥上，往鱼缸内加入天然海水并保证扩散盒内存有一定空气供微生物生长。培养时，使天然海水循环流动，并不断注入新鲜的海水。培养1周后培养基上产生大量的微型菌落，数目高达接种微生物的40％。该方法相比于前述的各种方法，能较大程度地模拟微生物所处的自然环境。然而，扩散盒法只是对一种新型的培养装置及其方法的尝试，由于在培养过程中每个扩散盒均需手工用微孔滤膜封闭，致使操作繁琐，且不宜大规模的工业化生产，严重限制其市场化推广使用。