[发明专利]一种RNAi载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及载体及其应用，特别是涉及一种基于SFV病毒复制子载体构建的RNAi载体及其在制备抑制靶基因表达的基因治疗性药物中的应用。

背景技术

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年生命科学领域重要的科研成果之一。它是一种转录后水平的基因沉默机制，通过双链RNA(dsRNA)与同源mRNA碱基互补配对，并引导核酸酶迅速降解结合位点的mRNA，从而阻断相应基因的表达，具有高稳定、高效率、高特异和高穿透的特点，故而被广泛运用在沉默特定基因上。比此前抑制基因表达的所有方法都更高效特异和简便易行。基于上述优点，RNAi技术在生物技术和生物医学中具有广阔的应用前景。目前，RNAi在线虫、果蝇以及植物等模式生物中的应用已经取得了较多成果(尤其是功能基因组研究)，在哺乳动物中的研究和应用也取得不少进展，特别是在抗肿瘤和抗病毒领域具有的重大潜在商用价值，已成为研究者及大众热切关注的焦点。

目前，实施RNAi的基本方法，包括以下步骤：

1、siRNA的设计与筛选；

2、siRNA的获得

目前，较为常用的制备siRNA的方法如下(汤华主编，RNA干扰原理与应用，科学出版社，2006)：

(1)化学合成

直接通过化学方法合成两条互补的21-23nt单链RNA，然后退火形成双链RNA。这是最早应用和目前仍为多数研究人员所采用的一种方法，简便可靠，周期短，可引入各种有益的化学修饰，但成本较高。

(2)利用质粒或病毒体内转录

通过转染含RNA聚合酶III启动子(RNA polymerase III promoter，pol III)或RNA聚合酶II启动子(pol II)及其下游一小段特殊结构的质粒或病毒载体到宿主细胞内，首先转录生成短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，然后被Dicer酶水解成siRNA发挥基因沉默效应。该方法相对麻烦，但可以发挥持续的抑制作用，利于长期研究。如果以病毒为载体则能进一步提高转染效率。

目前，已有大量质粒载体在医学等研究领域被广泛使用，病毒载体在应用上多用复制缺陷型腺病毒及逆转录病毒。

(3)体外转录及生物合成

A、T7 RNA聚合酶转录法：体外转录合成两条互补的单链RNA，然后退火形成双链siRNA。适用于筛选多种siRNA，尤其是需要制备多个siRNA而化学合成的成本较高时，但该方法不适用于对特定siRNA进行长期研究。局限性在于其设计、合成、终产物的纯化处理等技术要求严格，不能引入化学修饰，而且并非所有序列均能被很好地转录。

B、PCR合成法：以PCR方法为基础合成Pol III启动子-siRNA基因构建体，然后直接转染到细胞内表达。可快速检测siRNA在细胞中的作用，适用于筛选最有效的siRNA/靶序列组合。主要缺点是很难转染到细胞中。

C、重组人Dicer体外合成法：用体外转录的方法制备200-1000bp的双链RNA，然后用重组Dicer或RNaseIII在体外消化，得到各种不同的siRNA的混合物。该方法省时、省力，但有序列不确定性，可能导致非特异性的基因沉默。同时，siRNA混合物必须经仔细纯化，且同体外转录法一样，不能引入化学修饰。

3、siRNA的导入

体外研究RNA/重组质粒可用脂质体/电转法，重组病毒颗粒可直接转染；体内实验大多直接进行局部注射或静脉注射。但很难评价具体哪种方法能更有效地引起RNAi。

在RNAi技术大规模应用于临床之前，除siRNA自身的特异性外，还有以下问题亟待解决(陈煜，世界华人消化杂志，2006；14：2123)：

(1)siRNA导入细胞内的效率低：裸RNA或重组质粒转染虽然对细胞系有作用，但对原代细胞的作用还不够令人满意。电穿孔可引起细胞大量死亡(超过50％)，所以RNAi技术要想在实际的临床应用中获得成功，给药的方式还有待于进一步研究。目前，病毒载体在临床应用中是被看好的一条途径。另外，最近德国Vornloher等把siRNA附在一个靶向分子(脂溶性胆固醇)上也成功实现了靶向RNAi。