[发明专利]一种卵母细胞石蜡切片的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制备方法，具体地说是一种卵母细胞石蜡切片的制备方法，本发明方法特别适用于禽类卵巢细胞切片的制备。

背景技术

免疫组织化学(Immunochistochemistry)又称免疫细胞化学是指运用免疫学原理，通过特异的抗原抗体结合反应，并对抗体标记上可见的显色物来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。可以识别定位细胞中的各种组织成分，如酶、多肽、核酸、多糖、激素等，最后通过特异性染色可以在光学显微镜或荧光显微镜下观察其所在细胞中准确位置，利用细胞分光光度计、图像分析仪可对检测物进行细胞的原位定量测定。免疫组织化学技术特异性强、灵敏度高、定位准确并且简便快速，能够有机的同形态、功能及代谢的研究结合起来，适合具体研究组织和细胞中的一些理化因子的分布和功能。免疫组化检测通常需要先对样本进行包埋制片处理，如石蜡切片，冰冻切片等。在样本切片上进行理化因子的免疫学检测。

生物显微制片技术是研究细胞结构与组织化学的主要方法，而石蜡切片的制作是组织学和病理学中最常用的一种方法，适合于免疫组化检测的样本石蜡切片组织平面平整，厚薄适当，完整地保留组织的结构形态，染色效果好，反差强，并且可以长时间的保存。随着细胞生物学的发展和体外培养技术的进步，通过细胞培养研究卵母细胞的生长发育愈渐深入，对于卵母细胞结构尤其是关于其生长发育过程中的一些基因表达的产物和调控激素类物质的作用更是人们研究的热点之一，以往关于卵母细胞的发育研究通常采用卵巢局部组织切片来获得卵母细胞的生长发育信息，对局部卵巢组织进行切片优点是一张切片中可以包含很多处于不同发育时期的卵母细胞，缺点是由于其中除含有卵母细胞外还有疏松结缔组织等其它成分，在样本的脱水过程中由于其所含多种组织性质的不均一，导致缩水程度不一致，最后卵母细胞发生形变，无法保持其原有的形态结构；并且在免疫组化检测中会消耗大量昂贵的抗体，不仅不能使卵母细胞的特异性检测效果增强反而会导致非卵母细胞特异性染色的发生，增加背景干扰程度。如果要研究某个重要调控因子在雌性家禽卵母细胞中的作用，运用卵巢切片的方法还必须在不同时期杀死多只雌禽取样，这样不仅耗时耗力成本加大，周期延长，而且个体针对性不强，检测的准确性不高，置信区间变宽。

现在细胞体外培养的技术和条件均已成熟和完善，雌禽卵巢上卵母细胞的分离培养技术也已建立，一只雌禽卵巢上分离的卵母细胞在体外就可以培养到不同的发育阶段，因此越来越多的学者投向对家禽卵母细胞体外培养过程的研究，体外分离得到或经体外培养的家禽卵母细胞的初期直径通常小于400μm，石蜡包埋切片前的酒精脱水和二甲苯透明等复杂工序极易造成卵母细胞的结构破坏和丢失，所以广泛用于卵巢组织切片的常规石蜡包埋制片的方法，并不适合于少量甚至单个卵母细胞的切片制作，这为利用生物显微制片技术来对卵母细胞发育过程中的形态观察及一些理化因子的免疫组化检测带来不便。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种卵母细胞石蜡切片的制备方法，用于对微小卵母细胞样本制备石蜡切片，本发明方法特别适用于制备禽类卵母细胞切片。

本发明方法包括如下步骤：

1、固定：将卵母细胞样本用吸管转移到含有固定液的无色透明器皿中固定过夜，所述的固定液有10％的甲醛溶液、80-95％的乙醇溶液或5％醋酸溶液；

2、脱水及透明处理：用移液枪将卵母细胞从固定液中吸出，经脱水后，用移液枪将脱水后的卵母细胞转移到含有透明处理液的无色透明器皿中进行透明处理，所述的透明处理液为二甲苯、苯、甲苯或氯仿；

3、包埋及切片：将透明处理后的卵母细胞用移液枪转移到模盒中，去除透明处理液，露出卵母细胞，在卵母细胞周围点上有色染料，经石蜡包埋后切片。

本发明中的卵母细胞可以是从母体卵巢中中直接分离的卵母细胞也可以是经体外培养获得的卵母细胞；所用的透明器皿可以是玻璃器皿；可以用不同浓度梯度的酒精逐级脱水，具体可采用75％，85％，95％以及100％的酒精逐级脱水，每个梯度处理1小时；透明处理以1小时为宜；卵母细胞转移到模盒后，可以让透明处理液适当挥发或将其吸出，露出卵母细胞，以便观察和操作；所用的染料可以是伊红、品红、番红或次甲紫等不与石蜡反应的染料；可用常规程序包埋和切片。