[发明专利]嘌呤核苷磷酸化酶、腺苷脱氨酶、5’核苷酸酶的联合生产工艺

说明书

技术领域

本发明属于诊断酶制剂领域。

本发明涉及一种来自于芽孢杆菌(Bacillus sp.，ACCC10741)的嘌呤核苷磷酸化酶(PurineNucleoside Phosphorylase，PNP，酶学分类号为EC 2.4.2.1)的生产工艺，该酶对肌苷有专一的底物特异性而对腺苷和次黄苷酸没有底物特异性，可用于测定血清腺苷脱氨酶(AdenosineDeaminase，以下简称为ADA)和5’-核苷酸酶(5’-Nucleotidase，以下简称为5’-NT)的活性。本工艺可高效大量产生嘌呤核苷磷酸化酶，同时产生用于制备诊断试剂盒质控品的腺苷脱氨酶和5’-核苷酸酶，可通过纯化工艺逐一分离，经冷冻干燥后得到终产品。

技术背景

嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase，PNP，以下简称为PNP)，该酶根据底物特异性不同催化如下通用反应：

血清中的ADA为反映肝损伤的敏感指标，5’-NT的测定主要用于肝胆疾病的诊断及肝胆疾病与其他疾病的鉴别诊断，因而这两者是临床常做的生化检验项目。PNP在ADA和5’-NT的酶学检测中起到非常重要的作用。检测机理如下：

1)腺苷脱氨酶

2)5’-核苷酸酶

两者产生的次黄嘌呤都在XOD的作用下产生H₂O₂，最后偶联Trinder氏反应，比色测定：

此法灵敏度高，线性范围宽，试剂稳定性好。近年来，国内外学者对该法进行了深入的研究并加以改良，使之广泛地应用于临床。目前ADA和5’-NT商品化试剂盒多采用该法。

在图1中可以看到微生物嘌呤代谢过程中，PNP(EC 2.4.2.1)可以作用于多种底物，例如腺苷(Adenosine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、黄嘌呤(Xanthine)、鸟嘌呤(Guanine)、肌苷(Inosine)等。但是从前面所述的试剂盒检测原理来看，如果PNP对腺苷(Adenosine)或者次黄苷酸(Inosine 5’-Monophosphate Disodium Salt，IMP)有底物特异性，则必然对检测产生很大的干扰，最终影响试剂盒的准确度。如图2所示，腺苷与肌苷在分子结构上的差别非常微小，唯一的区别是嘌呤环上的取代基不同：腺苷是-NH₂取代，而肌苷是-OH取代，因此要求在ADA和5’-NT试剂盒中所使用的PNP有非常好的底物识别性。

现阶段所报道的PNP来源很多，不同来源的PNP底物特性性差异很大，表1中列举了不同来源的代表性PNP的底物特异性的不同：

表1不同来源的代表性PNP比较