[发明专利]嘌呤核苷磷酸化酶、腺苷脱氨酶、5’核苷酸酶的联合生产工艺

权利要求书

1.一种嘌呤核苷磷酸化酶的发酵生产方法，其特征如下：

1)将保藏号为ACCC10741的芽孢杆菌接在LB固体培养基上，LB固体培养基的成分有蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂、pH值为7.0-7.2、在高压灭菌锅中120℃，0.15MPa灭菌20分钟，30℃培养15-24小时长出单菌落；

2)将单菌落转接到种子罐扩大培养，罐中培养基成分有一定的碳、氮配比的蛋白胨与酵母粉、NaCl、MgSO₄、KH₂PO4，K₂HPO₄，pH值为7.0-7.2，在高压灭菌锅中120℃、0.15MPa灭菌20分钟；在30℃和不断搅拌通氧条件下培养，取样在紫外分光光度计上测定600nm的吸光度值，OD₆₀₀达到0.8～1.2之间进行下一步骤；

3)按照1～5％的接种量转接到发酵罐中，培养基成分包括一定量的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、尿素、NaNO₃，NaCl、MgSO₄、KH₂PO₄，K₂HPO₄以及诱导物肌苷，培养条件同步骤2，培养时间18-26个小时，600nm的吸光度值在15～18之间结束发酵；

4)发酵后的发酵液按照常规方法得到菌体，使用0.1倍发酵液体积的磷酸钾缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶，37℃温育1-2h，其中磷酸钾缓冲液的浓度为20-50mM，pH值为6.8-7.8，溶菌酶的终浓度为10～150mg/ml；

5)使用高压细胞破碎仪破碎细菌，4度下10000rpm离心20min去除菌体，得到胞内粗酶液；

6)在粗酶液中加入硫酸链霉素或者硫酸鱼精蛋白去除核酸杂质，离心步骤同步骤5)，使用硫酸铵进行初步分离，离心得到沉淀，复溶；

7)采取离子交换或者疏水层析使腺苷脱氨酶从复溶液中分离，得到腺苷脱氨酶，使用凝胶过滤收集第一峰得到5’核苷酸酶，收集第二峰得到嘌呤核苷磷酸化酶；

8)通过冷冻干燥最终得到终产品，产品成白色粉末状，在此过程中需要加入冻干保护剂，在-20℃保存可以稳定12个月。