[发明专利]猪苓伴生菌提高猪苓菌丝体产量及多糖含量的发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说是涉及一项利用真菌在液体发酵培养猪苓时提高猪苓菌丝体产量及菌丝体多糖含量的实用技术。

背景技术

猪苓[Polyporus umbellatus(Pers.)Fries]属多孔菌科真菌，其干燥菌核入药在我国已有2000多年的历史，是重要的传统中药。猪苓子实体俗称“猪苓花”、“千层蘑菇”，味道鲜美，可食。猪苓菌核具有利水渗湿的功效，为我国历版药典所收录。在上世纪70年代，日本学者首先从猪苓菌核中分离出了猪苓多糖，并证明它对动物移植性肿瘤有抑制作用。随后围绕猪苓多糖开展了很多研究工作。现已证明，猪苓多糖具有免疫刺激作用，可提高人体免疫力，对肺癌、宫颈癌、肝癌等多种癌症都有一定疗效，其抗癌效果已受到国内外医药界的普遍重视；同时，猪苓多糖在治疗慢性传染性肝炎和抗放射等方面也有良好的效果，猪苓多糖能显著降低肝脏中氧化清除自由基损伤的作用，对于延缓组织细胞老化、保护机体、抗老防衰十分有益。上世纪八、九十年代，我国已经有猪苓多糖注射液、猪苓多糖胶囊等产品问世，并在临床及日常保健中被广泛为应用。随着猪苓药用范围的扩大，加之缺乏有效的管理，由乱采滥挖而导致猪苓野生资源锐减，已很难满足市场需求。

发酵工程技术是通过现代微生物工程技术进行工业化规模生产的技术，是大部分生物技术药物工业化生产的关键。利用发酵技术进行药物的生产是现代生物技术制药的一个重要内容。真菌具有种类多、次生代谢产物丰富多样、培养条件简单等特点，针对食、药用真菌的自身发酵研究已经成为当前的研究热点。发酵技术具有生产周期短、产量高、产物质量稳定等特点，由此开辟了药用真菌生产的新途径。

已有研究表明发酵生产的猪苓菌丝体多糖与猪苓子实体多糖的红外吸收光谱相似，该多糖对Lewis肺癌及HAC肝癌的杀伤作用明显，具有调节免疫功能。从猪苓菌丝体中提取的多糖和从猪苓菌核中提取的多糖均能提高机体免疫力。

由此可见，通过工业发酵来生产猪苓菌丝体及多糖是解决当前猪苓供求矛盾的一条捷径，并能在一定程度上保护猪苓的野生资源，实现其资源的可持续利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用真菌的发酵产物来大幅度提高猪苓菌丝体产量及多糖含量的发酵方法。该方法操作简便，应用效果明显，用于猪苓菌丝体和猪苓菌丝多糖的工业化生产中，能提高生产效率，提高产量。

为实现上述目的，本发明采用的技术是先液体发酵培养真菌，再将真菌的菌丝体或发酵液以一定比例添加到猪苓的液体发酵体系中，从而提高猪苓菌丝体的产量及猪苓菌丝多糖的含量。本发明采用的真菌为分离自野生猪苓菌核的穴中并经过人工驯化和选育的菌株，经鉴定为猪苓伴生菌(Grifola sp.)GS-1，该菌种于2007年4月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.2023。保藏和存活证明见附件。

具体地说，本发明所述的技术步骤方法如下：

1.真菌GS-1的液体培养

将真菌菌株GS-1自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于24-26℃恒温培养20-30天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养30天；

GS-1液体培养的培养基：麦麸1-5％(煮汁)，葡萄糖1-4％，KH₂PO₄ 0.05-0.2％，MgSO₄0.05-0.2％，以上组分均按重量百分比含量计算，其余成分为水，pH 5.0-6.5，三角瓶或其他容器振荡，暗培养真菌，容器装量30-60％。培养基灭菌后接入真菌GS-1。培养条件：振荡转速100-150转/分钟；22-25℃暗培养；20-30天收获。

2.真菌GS-1在猪苓液体发酵培养的应用

上述菌株液体发酵培养后，发酵产物添加到猪苓的液体培养体系中，进行猪苓菌丝体的发酵培养。GS-1发酵产物的处理及添加方式为：

(1)液体培养的GS-1菌丝体，打碎后添加到猪苓的液体培养基中，经灭菌处理后接种猪苓菌种进行发酵生产。GS-1菌丝体的加入量以鲜重计算(W)为猪苓培养基体积(V)的0.5％-2％；