[发明专利]异戊酰螺旋霉素I基因工程菌株的构建

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程技术在改造抗生素组分中的应用。

背景技术：

异戊酰螺旋霉素I是本研究室利用基因工程技术构建的必特螺旋霉素(原名为生技霉素)产生菌所产生的一个组分[“生技霉素的制造方法”，专利号：ZL97104440.6]、[“必特螺旋霉素高产菌株的获得”，专利号：ZL 02148771.5]。必特螺旋霉素目前即将完成第III期临床实验。实验结果表明，在治疗呼吸道感染等疾病方面，显示了较好的临床疗效和安全性。

除异戊酰螺旋霉素I组分外，必特螺旋霉素成品中还包含异戊酰II和III组分，同时还含有少量4”丁酰基、丙酰基、乙酰基的衍生物及少量的螺旋霉素I、II、III(总含量应不超过5％)。目前现行的必特螺旋霉素成品质量标准中，规定其含有9个组分，4”酰化螺旋霉素总含量为80％，其中异戊酰螺旋霉素(I、II、III)3个组分的总含量为65％。而在必特螺旋霉素发酵液中还存在较大比例的螺旋霉素I、II、III，尤其II和III组分相对较多。必特螺旋霉素发酵液中的螺旋霉素主要依赖化学提取工艺将其清除。因此，抗生素发酵产品的多组分问题，给药品质量标准的制定以及发酵工艺和提取过程监控，经常带来很大的困难和挑战。所以，在不影响生物学活性的前提下，获得单一组分生产菌种，已成为抗生素研究和生产面临的重要课题。

必特螺旋霉素是以螺旋霉素为母核，利用基因工程技术在其4”位-羟基进行异戊酰基化所产生的。而螺旋霉素产生菌通常产生SPI、II、III三个组分，即内酯环3位分别为羟基(SP I)、乙酰基(SP II)和丙酰基(SP III)，结构式如图A所示。SP I、SP II、SP III三个组分的生物学活性基本一致。螺旋霉素产生菌产生SPI、II、III三个组分的生化机理，是由3-O-酰基转移酶催化内酯环3-O-羟基所致。本研究室曾在获得螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因序列(专利申请号200610087230.1，SEQ ID No.1)基础上，通过基因阻断技术，获得了主要产生螺旋霉素组分I的菌种。但是，仅仅产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的菌种，迄今尚未见到相关报道。

                          螺旋霉素结构

本发明的目的在于，借鉴上述成果，在必特螺旋霉素产生菌中通过破坏编码3-O-酰基转移酶基因，以获得产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。

发明内容：

根据已经获得的3-O-酰基转移酶基因及其两翼序列，在3-O-酰基转移酶基因序列中可以破坏该基因的任意区段设计1个引物，并插入4个任意设计的酶切位点，经PCR获得两个1.0kb左右的同源臂，酶切后将两个同源臂互连，另外两侧与能转入必特螺旋霉素产生菌的载体相连接，以必特螺旋霉素产生菌(ZL02148771.5，菌种保藏号：CGMCC No.0304)总DNA为模板，经PCR分别扩增两个与3-O-酰基转移酶基因同源片段，并以相应酶切位点插入具有选择性标记的链霉菌/大肠杆菌穿羧质粒载体，也可在两个同源基因中插入和使用质粒不同的选择性标记片段，构建重组质粒。将所构建的重组质粒转入必特螺旋霉素基因工程菌，以质粒上携带的选择性标记筛选转化子，根据转化子展现的选择性标记差异和PCR验证，获取因同源基因双交换而使3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌，称之为BT3-O-ATΔ变株。该基因工程菌在一定条件下，经发酵培养和产物的初步化学提取以及HPLC检测其发酵产物，证明本发明提供了产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。

发明效果：

本发明利用基因工程技术将原必特螺旋霉素基因工程菌中的3-O酰基转移酶基因实施破坏，获得了只产生异戊酰螺旋霉素组分I的菌种。该菌种的获得，，使得必特螺旋霉素类抗生素发酵液中的多组分状况获得明显单一化，这将有助于简化生产过程发酵工艺的调控，实现提取过程的优化，提高收率，降低能耗和生产成本，为推进必特螺旋霉素类抗生素的产业化创造良好条件。

附图说明：

图1.用于3-O-酰基转移酶基因破坏的重组质粒pKCL1-4的构建及同源双交换

其中：Apramycin(阿普霉素抗性标记)；

      GTG和TGA表示3-O-酰基转移酶基因阅读框的起始和终止密码子；

      a，b，c，d为PCR反应所设计的引物。

图2.染色体基因组PCR产物电泳(确证3-O-酰基转移酶基因的破坏)

其中：1.基因工程菌BT3-O-ATΔ变株；

      2.必特螺旋霉素产生菌原株；