[发明专利]单个细胞的基因表达定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及将来自单个细胞的cDNA固定化到载体上得到的来自单个细胞的cDNA固定化载体文库作为解析试样的基因表达的定量解析方法。本发明还涉及将来自少量细胞的cDNA固定化到载体上得到的cDNA固定化载体文库作为解析试样的基因表达的定量解析方法。

背景技术

作为过去具有代表性的基因表达解析方法，有微阵列法以及实时PCR法，这些以往的方法多数用多个细胞构成的组织片或者多个培养细胞(～10⁶个)作为解析试样。因为在实际的细胞内，随着时间的变化，基因的表达量发生各种变化，所以即使在相同的组织中，根据位置不同，每个细胞中的基因的表达也存在时间差异。因此，将组织和多个细胞作为试样的解析是平均了每个细胞的差别进行测定的。根据这样的数据难以得到动态变化的活着的生命的详细信息。具有生命的进行生物活动的最小单位的每个细胞中发生的生命现象都不相同，此外，用多个细胞作为解析试样的以往的基因表达解析中，难以综合性地解析细胞单独以及细胞间的生命活动。

最近，将生命作为系统加以研究的活动开始活跃。从作为生命系统的最小单位的细胞出发，为了了解生命系统，有必要对单个细胞所含有的全部分子进行分析，对细胞进行统一的解析。认为例如：在与激素和神经传递物质等生物体内的信息传递相关的组织、以及开始阶段的胚组织中，基因的表达量在各细胞中存在很大的差别。因此，单个细胞水平的基因表达解析的必要性很高。

近年来，通过试剂、检测装置等相关的显著的技术发展，实现单个细胞水平的基因表达的解析成为可能，令人深感兴趣的分子生物学性发现被报道，并引起人们的关注。不过，因为单个细胞中含有的mRNA极其微量，所以如果不解决检测灵敏度的问题，依然会局限在高表达的基因才有可能被解析。

在基因组解析时代，如何高效地解读未知的DNA序列被当成重点而进行技术开发。与此相对，在后基因组时代，将细胞作为系统进行理解，寻求的是能够高灵敏度地解析在各个单个细胞中表达的mRNA中，来自怎样的基因的mRNA、以何种程度存在的方法。这样的情况下，作为有效地回收mRNA分子、合成cDNA的方法，提出了使用寡(dT)固定化磁珠捕捉mRNA，进行逆转录反应的方法(专利文献1以及专利文献2)。

在上述的现有技术中可能存在下述技术问题。首先，专利文献1以及专利文献2所涉及的方法中，从多个细胞预先提取、纯化1μg的RNA(相当于10⁵个细胞)，再将稀释后的微量RNA溶液作为启始材料。即，实际上，并不是从单个细胞中提取RNA。专利文献1以及专利文献2记载的RNA提取法以及纯化方法需要从一个管到另外的管反复移动试样的操作、和使RNA吸附玻璃上，反复清洗玻璃的操作，因为伴随着RNA试样的损失，所以回收单个细胞中含有的极微量的RNA(约10pg)是很困难的。此外，在这样的以往的方法中，由于每个样品的回收率都很不均一，所以不利于定量解析。此外，在专利文献1以及专利文献2涉及的方法中，在进行在磁珠上的逆转录反应后，为了实施任何常规的PCR扩增步骤，该步骤导致在原来试样中存在的来自各种基因的mRNA分子的绝对数以及存在比发生了变化，不适于作为定量解析试样。

另一方面，用于单个细胞的基因表达解析的、在1个管子中进行细胞溶解步骤、DNase处理步骤、逆转录步骤的试剂盒已经开始销售。利用本试剂进行cDNA合成，操作容易，不存在通常的核酸提取、纯化所伴随的解析试样的损失以及回收率不均一的问题。不过，因为使用该试剂合成的cDNA溶液夹带有残留试剂，抑制了PCR扩增反应，所以很难进行使用来者单个细胞全部cDNA的实时PCR解析。因此，为了降低残留试剂导致的PCR扩增抑制，必须使用再次分份的来自单个细胞的cDNA作为解析试样，导致实时PCR解析的检测灵敏度大幅度降低。而且伴随着解析，消耗了来自单个细胞的cDNA，所以可能限制了能够解析的基因的种类。

【专利文献1】特开2002-238575号公报

【专利文献2】特开2005-46138号公报

发明内容

【发明所要解决的问题】

鉴于上述问题，本发明的目的在于提供适合于单个细胞的基因表达的定量解析的方法。

【用于解决问题的手段】