[发明专利]耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法。

背景技术

上世纪50年代发现的糖肽类抗生素万古霉素由于其独特的作用机制而被用作治疗多重耐药G+菌感染的首选药物，曾一度被誉为“人类对付顽固性多重耐药G+菌感染的最后一道防线”。但随着耐万古霉素肠球菌Vancomycin Resistant Entorecoccus(VRE)的出现，这最后一道防线也面临着崩溃的危险。VRE在临床上不仅能引起尿路感染、腹腔、盆腔感染及外科手术伤口感染、菌血症、心内膜炎、脑膜炎等等，而且还能将其抗性转移到其他病原微生物。因此，对人类构成严重威胁的不仅是VRE本身，还包括它们的耐药因子的转移将产生一些难以治疗的新耐药菌株。加强VRE检测不仅有利于指导临床用药，而且有利于VRE抗性转移检测、控制。目前，临床上VRE检测主要方法是通过抑菌试验来检测，这种检测方法不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性低，而且无法了解抗性引起的分子生物学机制。

随着分子生物学技术的飞速发展，人们已经将实时荧光PCR技术(real-timefluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临床检验包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测，也包括多种病毒、细菌耐药性检测。实时荧光PCR(real-time fluorescencepolymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。目前临床用的PCR检测技术基本全部采用实时荧光PCR技术。实时荧光PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。

目前应用于临床检验的实时荧光PCR检测试剂盒，多数是单检试剂盒，少数为双检或三检试剂盒。引起临床病原微生物耐药的原因往往是多因素的，常常需要检测多个因素才能确定耐药原因，这就对检测试剂盒提出了更高的要求：又快又能同时检测多种耐药的原因。

发明内容

研究表明肠球菌耐万古霉素主要是由位于肠球菌基因组或质粒上的抗性基因引起，根据抗性基因差异分为VanA型、VanB型、VanC型、VanD型四种，其中只有VanA型、VanB型具有临床检测意义。目前VRE检测技术(抗生素抑菌试验)操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性低，而且无法检测到抗性引起的分子生物学机制。为了克服目前检测技术不足，本发明采用一种双重实时荧光PCR技术检测VRE。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种双重实时荧光PCR技术检测VRE方法。根据目前引起肠球菌耐万古霉素的主要因素VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增的方法，利用探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，Ct值0或大于37：阴性；Ct值小于36：阳性。

本发明的双重实时荧光PCR方法包括以下步骤：

1、确定代检测的特异性基因---即扩增序列VanA、VanB基因序列；

2、根据扩增序列VanA、VanB基因分别设计引物、探针，VanA设计一对引物1，探针1，VanB基因设计一对引物2，探针2；其中探针1，2标记不同的荧光物质；

3、双重实时荧光PCR反应体系组成：PCR缓冲液，两对引物、两条探针，反应用Taq酶、UNG酶，DNA模板。

VRE双重实时荧光PCR扩增反应体系：

5×PCR缓冲液(mix)              8μl

P VanA(80pmol/μl)             0.5μl

P VanB(80pmol/μl)             0.5μl

FP VanA(60pmol/μl)            0.5μl

FP VanB(60pmol/μl)            0.5μl