[发明专利]耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR检测方法

权利要求书

1、一种双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法以及试剂盒的组成，根据待测耐万古霉素肠球菌VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增待测两种万古霉素抗性基因的特异性核苷酸序列。本发明采用荧光双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长，波长1检测探针FPVanA标记的荧光染料强度，Ct值0或大于37：VanA阴性，Ct值小于36：VanA阳性；波长2检测探针FPVanB标记的荧光染料强度，Ct值0或大于37：VanB阴性，Ct值小于36：VanB阳性。本试剂盒针对耐万古霉素肠球菌而设计，具有特异性高、灵敏、抗污染、快速等特点，可准确、快速、特异、方便的检出耐万古霉素肠球菌，并能够准确判断其耐药的遗传学机制。按照权利要求1所述的双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法，其特征在于：所述双重实时荧光PCR扩增基因序列的反应体系为：

5xPCR缓冲液(mix)            8μl

P VanA(80pmol/μl)          0.5μl

P VanB(80pmol/μl)          0.5μl

FP VanA(60pmol/μl)         0.5μl

FP VanB(60pmol/μl)         0.5μl

Taq酶(2U/μl)               1μl

UNG酶(0.1U/μl)             1μl

模板                        2～5μl

ddH₂O                      26～29μl

总反应体积：40μl

5XPCR缓冲液组成成分：

250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl₂、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uM dGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。

2、按照权利要求1所述双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法，其特征在于：

所述DNA提取液由两部分组成

DNA提取液1：20％PEG6000、1MNaCl、1％SiO2。

DNA提取液2：20mmol/LNaOH、10mmol/LTris-HCl(pH 8.0)、0.1mmol/L EDTA、1％TritonX-100和1％NP-40。

3、按照权利要求1所述双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌试剂盒组成，其特征在于：根据临床肠球菌耐万古霉素的主要因素是VanA、VanB两种抗性基因引起的，我们分别选择VanA、VanB基因的保守序列设计两对引物、两条探针，其中探针分别标记不同荧光染料，采用互不干扰的两种波长进行荧光强度检测。两对引物、两条探针设计的Tm值接近，相差不到2℃。

4、按照权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述待测核酸是肠球菌抗性基因VanA，所述特异性核酸序列为：

  1 GCAGCTTGCA TGGACAAATC ACTGGCCTAC ATTCTTACAA

 41 AAAATGCGGG CATCGCCGTT CCCGAATTTC AAATGATTGA

 81 TAAAGGTGAC AAGCCGGAGG CGGGTGCGCT TACCTACCCT

121 GTCTTTGTGA AGAGCAGGCT GTTTCGGGCT GTGAGGTCGG

161 TTGTGCGGTA T

5、按照权利要求5所述的试剂盒，其特征在于设计的引物、探针序列为：

特异性引物：

P VanA 1：5‘-CGC AGC TTG CAT GGA CAA AT-3‘20bp

P VanA 2：5‘-CAC TCC AGC CAA CAC GCC AT--3‘20bp

特异性探针：

FP VanA：5‘---ATT GAT AAA GGT GAC AAG CCG GAG GC---3‘26bp