[发明专利]一种筛选活性组分或物质的方法及依其制得的活性组分

权利要求书

1.一种结合生物传感器技术和分离技术、从天然药物或天然药物提取物中筛选、分离具有与PBP2a结合活性的活性组分或活性单体化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将PBP2a直接包被于生物传感器的羧基化样品池或生物素化的PBP2a包被于亲和素化样品池作为固定相配基，使PBP2a结构上发挥重要生物学作用的C末端外露并游离，以此作为天然药物中活性物质与固定相发生结合作用的靶点；

(2)以待筛选的天然药物提取物溶液为作为流动相，利用上述生物传感器使其与上述固定相配基作用，筛选能够与PBP2a发生结合作用的天然药物或天然药物提取物；

(3)将筛选出的与PBP2a具有较强结合活性的天然药物提取物，经柱层析法和/或高效液相色谱法进行分离纯化，对所得到的不同纯化组分再通过生物传感器进行至少一次结合活性的检测，得到能与PBP2a发生结合的活性组分或单体化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a由MRSA来源的DNA经常规基因工程方法将其在大肠杆菌中表达后分离纯化制得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶点为耐药性金黄色葡萄球菌PBP2a的第27～668位氨基酸或第327～668位氨基酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PBP2a生物素化的步骤采用生物素化试剂BAC-SulfoNHS，通过与可溶性PBP2a片段上的游离氨基端形成稳定的酰胺键完成。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a的包被包括以下步骤：

(1)以PBST反复清洗样品池，至基线平衡；

(2)向样品池PBST中加入亲和素；

(3)PBST反复清洗，加入生物素标记的PBP2a；

(4)PBST清洗2-5次后，采集数据曲线3～l0min，计算包被值。

6.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述天然药物提取物为水提取物和/或有机溶剂提取物；所述柱层析法为离子交换柱层析或硅胶柱层析；所述高效液相色谱法为反相高效液相色谱法或正向高效液相色谱法。

7.一种能与PBP2a发生结合作用的活性组分，其特征在于，其采用权利要求1至6中任一项所述方法从天然药物中筛选、分离得到。

8.根据权利要求7所述的活性组分，其特征在于，所述天然药物为黄连，该组分通过以下步骤制备：

(1)黄连根或须提取液经过与PBP2a的结合、解离反应后，分别再用亲合反应液反复冲洗，经盐酸溶液洗脱、再生后，将回吸收的再生反应液pH调为中性，冷冻抽干；

(2)应用生物传感器的回收功能，通过洗脱，得到各梯度洗脱组分，对这些组分进行PBP2a结合测定，取与PBP2a结合力最高的组分；

(3)将上述所得与PBP2a结合力最高的组分提取液pH值调至3.0～5.0，静置后取上清液过离子树脂，收集滤过峰、双蒸水洗脱峰和氨洗脱峰，浓缩，低温冷冻抽干；

(4)分别取适量上述提取物冻干粉末，以生物传感器检测各组分与PBP2a的结合力，取结合力最高的氨洗脱峰对应的提取液；

(5)上述氨洗脱峰提取液静置后离心弃沉淀，上清液调整pH值为6.0～6.5，静置后离心，合并两次上清液，上清液上硅胶柱，以不同浓度的氯仿和乙醇洗脱，并分别收集洗脱液A、B、C，浓缩，低温冷冻抽干；

(6)分别取适量上述洗脱液A、B、C的冻干粉末，测定其与PBP2a的结合力，取结合力最高的C组分；

(7)将上述与PBP2a结合力最高的C组分进行高效液相色谱分离，色谱条件：色谱柱柱温25℃，流速15ml/min，进样浓度200mg/ml，检测波长275nm，分别收集流出峰，负压抽干；

(8)以生物传感器测定上述各流出峰与PBP2a的结合，与PBP2a结合力最大的95.0～100.0min流出峰所对应的组分即为活性组分HL2。